[發明專利]不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法

有效

• 申請號: 201410475782.4
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104212827B
• 公開（公告）日: 2017-07-04
• 發明（設計）人: 蘇丹;陳義平;周明;曹磊;李輝艷;蘇小茗
• 申請（專利權）人: 四川大學
• 主分類號: C12N15/66
• 分類號: C12N15/66;C12N15/10
• 代理公司: 成都虹橋專利事務所(普通合伙)51124
• 代理人: 梁鑫

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法。

背景技術

繼人類全基因組測序圖譜完成后，多個物種的全基因組序列圖譜亦被相繼完成。基因序列的一級結構信息，為人類探索單個基因及相關蛋白結構、功能提供了信息基礎。由此，人類進入了后基因組研究時代。然而，面對海量的基因序列信息，傳統分子克隆技術效率低下，成本耗費過高，隨機誤差較大，已經不能滿足科研需求，分子克隆技術的瓶頸限制了對各物種基因的全面深入的分析和研究。隨著更多物種的全基因組測序工作的完成，以及更多新物種的發現，后基因組研究迫切需要出現一種全新的高通量分子克隆技術。

在傳統的分子克隆方法的基礎之上，出現了很多新的基因克隆方法，其中包括使用同源重組序列、特異性連接頭、快速連接酶等新技術。但所有這些新方法的建立，都需要使用相應的生物工程酶，如各類重組酶、T4連接酶、限制性內切酶等。這些生物工程酶的使用，增加了實驗流程的復雜性性，同時也加大了實驗成本。為了解決分子克隆實驗流程復雜，費用高，質量控制難度大等瓶頸問題，本領域需要在分子克隆的方法學上有新的突破。

發明內容

本發明要解決的技術問題是本領域分子克隆需采用多種生物工程酶，導致實驗流程復雜，費用高的問題。

本發明解決上述技術問題的技術方案是提供一種不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法。

該不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法包括以下步驟：

a、引物設計和合成；分別設計和合成兩對引物，第一對為目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR，第二對為載體正向引物VF和載體反向引物VR；

b、進行PCR，分別獲得線性目的基因和線性目的載體DNA；

c、將兩次PCR產物混合放置，使線性目的基因和線性目的載體DNA自發連接成環狀，得到含有目的基因的載體。

進一步的，上述方法還包括步驟d：以步驟c所得產物轉化細菌。

更進一步的，上述方法還包括步驟e：挑選單克隆菌落提取質粒，進行PCR驗證及測序鑒定，得到含有目的基因的重組載體。

其中，上述方法步驟a所述目的基因正向引物IF和目的基因反向引物IR中，目的基因正向引物IF含有Overlap I1引物和I2引物兩部分，Overlap I1引物部分的序列與目的載體插入位置的5’端的12-21個堿基的序列相同，I2引物部分的序列與目的基因5’端10-30個堿基的序列相同；IR同樣含有兩個部分，分別為Overlap I3引物和I4引物，Overlap I3引物的序列與載體插入位置3’端序列12-21個堿基序列反向互補，I4與目的基因3’端10-30個堿基的序列反向互補，其中I1與I3堿基數量相等，堿基數量12-21個均可。

優選的，上述方法步驟a所述目的基因正向引物IF的I2引物部分的序列與目的基因5’端的前20個堿基的序列相同；目的基因反向引物IR I4與目的基因3’端的最后20個堿基的序列反向互補。

其中，上述方法步驟a所述載體正向引物VF和載體反向引物VR是以載體的5’至3’方向為參考，VF與載體待插入位置3’端的24-30個堿基序列相同，VR與載體待插入位置5’端24-30個堿基序列反向互補。

本發明的兩對引物設計的方法可參見示意圖10。

其中，上述方法中的細菌為大腸桿菌。優選為DMT感受態大腸桿菌。

其中，上述方法步驟C所述的混合放置為在室溫下進行，時間為30～90分鐘。進一步的，所述的混合放置的時間30～60分鐘。

其中，上述方法中所述的載體為質粒。

本發明不依賴生物工程酶的快速分子克隆方法與傳統的分子克隆技術相比較，具有高速、高效、低成本，隨機誤差低等優點。與目前已有的快速克隆方法相比具有更明顯的優勢，即在整個實驗流程中，無需使用任何限制性內切酶，連接酶、重組酶體系等工程酶，僅需使用DNA聚合酶。尤為可貴的是該技術連接頭設計方法獨特，不受商業載體中限制性酶切位點的限制，可以將基因插入到質粒任何位置，可以大大擴展分子克隆使用的載體的種類，可對載體進行任何改造

此外本發明方法的過程極為簡便，將過去一個熟練技術人員需要三到四天的工作，縮短到2天內完成，工作時間縮短了30％～50％。實驗成本耗費降低可達50％，成功效率達到90％。具有廣闊的應用前景。

附圖說明