[發明專利]一種羧酸酯酶基因dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應用

有效

• 申請號: 201410474665.6
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104293809B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 趙章武;梁榮奇;鄧菲
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/63;C12N1/21;C12N1/15;C12N1/19;A01N63/02;A01P7/04
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• 代理人: 關暢

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種羧酸酯酶基因d_sRNA及其在防治麥長管蚜中的應用。

背景技術

小麥是我國的主要糧食作物。小麥田內害蟲種類很多，主要害蟲有地下害蟲、小麥吸漿蟲、麥蚜、麥蜘蛛、食葉的粘蟲等,其中麥蚜對小麥的危害最為嚴重。麥蚜屬同翅目蚜科，俗稱膩蟲、由汗、蜜蟲等，是我國小麥上的主要害蟲之一。其種類主要包括麥長管蚜(Sitobion?avenae)、麥二叉蚜(Schizaphis?graminum)、禾谷縊管蚜(Rhopalosiphum?padi?Linnaeus)、麥無網長管蚜(Acyrthosiphon?dirhodum)等。麥長管蚜、麥二叉蚜和禾谷縊管蚜在世界各個地區廣泛分布，我國小麥種植區內均有發生。麥二叉蚜主要分布在西北、華北地區，麥長管蚜危害南北麥區，禾谷縊管蚜在南方地區發生嚴重。麥蚜的發生受氣候影響較大，在小麥生不同的生長期內，麥蚜的危害優勢種有所不同，在小麥拔節期，麥二叉蚜種群密度大，到達抽穗期，麥長管蚜逐漸變為優勢種，麥二叉蚜與麥長管蚜混合發生，小麥抽穗以后，禾谷縊管蚜發生嚴重。

麥蚜以若蚜、成蚜聚集在小麥葉片、莖干，吸食小麥汁液，造成小麥葉片出現黃斑或枯萎，在苗期危害嚴重時造成小麥苗枯死，后期危害穗部，造成小麥籽粒干癟，使小麥品質變劣，產量降低。麥蚜排出的廢物覆蓋在葉片上使葉片變黑，光合作用受到嚴重影響。此外，麥蚜還分泌毒素，傳播病害，嚴重影響小麥產量和品質。因麥蚜的危害造成小麥減產一般在10％-20％，麥蚜危害嚴重時小麥減產量達到30％。麥蚜還可以傳播小麥與大麥黃矮病毒，使小麥產量降低。

RNAi的基本過程包括起始階段和效應階段。在起始階段，dsRNA穿過細胞膜進入細胞后，細胞質中的一種RNA酶Ⅲ家族的內切酶Dicer酶特異識別dsRNA，Dicer酶將dsRNA切割成許多21bp-23bp的小片段(small?interference?RNA，siRNA)，每個siRNA都有2個突出的核苷酸。效應階段，siRNA與一個酶復合物形成一種沉默復合物(RNA-indueed?sileneeing?eomplex，RISC)。在ATP存在的前提下，攜帶的雙鏈siRNA被RISC變成單鏈siRNA分子，變成具有活性的RISC(Slicer)。之后Slicer與外源性基因表達的mRNA分子結合，RISC在結合部位開始切割mRNA。切割后的mRNA誘導細胞降解這些mRNA片段。siRNA還能引導目的RNA結合RNA聚合酶(RNA-dependent?RNA?polymerase,RdRP)，合成新的dsRNA，然后由Dicer酶切割產生新的siRNA，又引發新一輪的合成切割過程，沉默信號逐漸擴大。

目前常用的dsRNA導入的方法有注射法、浸泡法、飼喂法、組織培養法、植物介導法等。注射法是通過顯微注射儀將dsRNA導入到昆蟲體內，是目前最常用的方法。這種方法既有優點又有缺點，優點是效率高，缺點是體外合成保存dsRNA成本高，難以避免注射的傷口影響昆蟲生長。浸泡法是用dsRNA溶液浸泡昆蟲組織或細胞，可以有效地抑制基因表達。浸泡法有一定的局限性，只適合于昆蟲一定的發育階段和易吸收dsRNA的細胞組織，在研究中應用較少。飼喂法操作方便且簡單，對昆蟲的影響小。喂食dsRNA在許多昆蟲中都取得了成功，例如半翅目、鱗翅目、鞘翅目昆蟲。組織培養法將dsRNA混入培養基，昆蟲細胞從培養基里吸收dsRNA。目前利用這種方法取得成功的昆蟲有果蠅、埃及伊蚊、白紋伊蚊。這種方法要求的培養基條件嚴格，不容易培養得到符合要求的細胞，對這種方法的使用受一定限制。轉基因植物介導法是借助植物持續不斷的產生穩定的dsRNA，昆蟲持續取食這種植物會不斷的攝入dsRNA。但是這種方法也有一定的局限性，不同昆蟲或同一昆蟲的不同基因對通過口腔進入的RNAi的敏感性不同，影響喂食dsRNA的成功率的關鍵因素是昆蟲的上皮細胞攝入dsRNA的效率。Walshe等發現利用喂食方法可以抑制刺舌蠅(Glossina?morsitans?morsitans)中腸表達TsetseEP，卻不能抑制脂肪體的傳遞蛋白基因2A192的表達。

發明內容

本發明的目的是提供一種羧酸酯酶基因(CarE基因)dsRNA及其在防治麥長管蚜中的應用。

本發明所提供的dsRNA，具體為由序列表中序列1所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。

編碼所述dsRNA的DNA分子也屬于本發明的保護范圍。

所述DNA分子的核苷酸序列具體為序列表中序列2。