[發(fā)明專利]一種制備虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410474006.2
• 申請日: 2014-09-17
• 公開（公告）號: CN104189899A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設計）人: 柳紀省;李寶玉;楊彬;李學瑞;蘭喜;殷相平;李志勇;張韻;方玉萍
• 申請（專利權）人: 蘭州威特森生物科技有限公司
• 主分類號: A61K39/205
• 分類號: A61K39/205;A61P31/14;C12N7/00;C12R1/93
• 代理公司: 甘肅省知識產權事務中心 62100
• 代理人: 李琪

技術領域

本發(fā)明屬于生物制品技術領域，涉及一種虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗的制備方法。?

背景技術

傳染性造血器官壞死癥（INH）是彈狀病毒科的虹鱒傳染性造血器官壞死癥病毒(Infectious?Hematopoietic?Necrosis?Virus，IHNV)引起的分布廣泛、死亡率高、危害極大的魚類病毒性傳染病，1985年開始在我國東北地區(qū)各養(yǎng)鱒場陸續(xù)發(fā)現，目前有蔓延和加劇的趨勢。而且近幾年來，我國每年從國外引進大批的鮭魚魚卵，但因檢疫技術不完善，致使危害嚴重、傳播力強、防治困難的傳染性造血器官壞死癥傳入我國并蔓延開來，使正在發(fā)展中的我國虹鱒養(yǎng)殖業(yè)留下了無窮禍患和潛在危機。?

近年來國內的虹鱒魚養(yǎng)殖場大多從外地購進發(fā)眼魚卵自行孵化魚苗，當上浮稚魚攝食一月左右時大面積爆發(fā)疫情，表現為病稚魚體發(fā)黑，游動遲緩，隨水漂流，有時出現痙孿動作，有時一邊翻滾、一邊漂流，或靜臥池底或狂游沉入池底而死亡，腹部膨大，有淤血斑，肌肉“V”字型或線型出血，尾柄充血，腹鰭基部和肛門周圍充血，有的在肛門拖著長而不透明的白色糞便，死亡率達90%以上，給虹鱒魚的養(yǎng)殖造成毀滅性打擊。為保障我國養(yǎng)鱒業(yè)的快速、健康發(fā)展，研究安全、高效的IHN疫苗具有很重要的現實意義。?

目前國際上還沒找到對IHN防控的有效辦法，僅有的DNA疫苗處于試驗階段。國外對感染IHN的病魚采取的措施是全部銷毀，對養(yǎng)殖場地和設備進行全面消毒。在我國，對于養(yǎng)殖者來說，只考慮當前的經濟損失，不考慮長遠利益，僅僅是想辦法推遲和減輕病魚的死亡，致使IHN傳播范圍愈來愈廣泛。?

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的是提供一種制備虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗的方法，用于制備安全、高效的虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥的滅活疫苗。?

為實現上述目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一種制備虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗的方法，采集發(fā)病但未死亡的稚魚胰腺和肝臟，經研磨、過濾和浸毒處理后，接種虹鱒魚性腺細胞，在14℃條件下盲傳，盲傳至第十代時五天收集細胞毒液；接種大鱗大馬哈魚胚胎細胞，從14℃開始傳代，每傳五代培養(yǎng)溫度升高1℃，直至培養(yǎng)溫度升高至20℃；用鯉魚上皮瘤細胞在20℃條件下繼續(xù)傳代，傳至第十二代，得到高滴度的病毒液，經滅活后制成虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗。?

本發(fā)明制備方法利用RTG-2細胞、CHSE-214細胞和EPC細胞在特定的環(huán)境溫度下交替培養(yǎng)虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥病毒（IHNV），獲得大量的高滴度IHNV抗原，生產滅活疫苗；解決了用單一細胞無法獲得高滴度IHNV抗原的技術難題。?

附圖說明

圖1是用于鑒定IHNV的部分核蛋白基因RT-PCR產物的電泳圖。?

圖2是正常的EPC細胞。?

圖3是接種IHNV三天后的EPC病變細胞。?

圖4是免疫IHN傳統疫苗后同居感染攻毒試驗結果置于爆發(fā)IHN疫情下游的對照組。?

圖5是免疫IHN傳統疫苗后同居感染攻毒試驗結果置于爆發(fā)IHN疫情下游的試驗組。?

具體實施方式

下面結合附圖和具體實施方式對本發(fā)明進行詳細說明。?

本發(fā)明提供了一種制備虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗的方法：從爆發(fā)傳染性造血器官壞死癥疫情的虹鱒魚養(yǎng)殖場采集發(fā)病但未死亡的稚魚，取其胰腺和肝臟經研磨、過濾和浸毒處理后，接種生長三天后的虹鱒魚性腺細胞（RTG-2），在14℃條件下盲傳，盲傳至第十代時五天出現典型病變，收集細胞毒液；用收集的毒液接種大鱗大馬哈魚胚胎細胞（CHSE-214細胞），從14℃開始傳代，每傳五代培養(yǎng)溫度升高1℃，直至培養(yǎng)溫度升高至20℃；用鯉魚上皮瘤細胞（EPC細胞）在20℃條件下繼續(xù)傳代，傳至第十二代時病毒毒價可穩(wěn)定達到4.2×10⁹TCID₅₀，得到高滴度的病毒液，經滅活后制成虹鱒魚傳染性造血器官壞死癥滅活疫苗。RTG-2細胞和CHSE-214細胞購自上海海洋大學保藏中心；EPC細胞購自中國動物檢疫研究所；發(fā)病但未死亡的稚魚來自甘肅永登爆發(fā)傳染性造血器官壞死癥疫情的虹鱒魚養(yǎng)殖場。?

由于冷水魚細胞生長速度慢，病毒繁殖也慢，用單一的RTG-2或CHSE-214細胞無法獲得高滴度的IHNV。本發(fā)明方法先用對IHNV敏感的RTG-2細胞從病料中分離到流行毒株，然后用CHSE-214細胞對分離到的毒株進行馴化，使其逐漸適應較高的繁殖溫度以便能在EPC細胞上高效繁殖，獲得高滴度的病毒用于制備滅活疫苗。?