[發(fā)明專利]EB病毒VCA-IgA抗體檢測試劑及其制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410472934.5
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104280549A
• 公開（公告）日: 2015-01-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 唐安洲;王勝嵐;葉為民;張哲;宋小冬;李峰
• 申請（專利權(quán)）人: 中山生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/531;G01N33/569
• 代理公司: 北京律誠同業(yè)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11006
• 代理人: 黃韌敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種抗體檢測試劑。

本發(fā)明還涉及包含該檢測試劑的試劑盒及制備方法。

背景技術(shù)

EB病毒(epstein-barr?virus,EBv)，又稱人類皰疹病毒4型(Human?herpesvirus?4(HHV-4))。Epstein和Barr于1964年首次成功地將Burkitt非洲兒童淋巴瘤細(xì)胞通過體外懸浮培養(yǎng)而建株，并在建株細(xì)胞涂片中用電鏡觀察到皰疹病毒顆粒，認(rèn)為該病毒是多種惡性腫瘤(如鼻咽癌)的病因之一，它主要感染人類口咽部的上皮細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞。在中國南方鼻咽癌患病人群中大多都檢測到有EB病毒基因組存在。EB病毒分布廣泛，多呈散發(fā)性，亦可引起流行。EB病毒與鼻咽癌關(guān)系十分密切,鼻咽癌病人血清中EB病毒VCA-IgA抗體水平明顯升高。VCA-IgA抗體與鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后均有密切關(guān)系。

目前檢測EB病毒VCA-IgA的檢測試劑主要是采用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法、Real-time定量PCR法等，但存在操作復(fù)雜、檢測靈敏度較低、檢測時間長的缺陷。

膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑如白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，形成帶負(fù)電的疏水膠溶液，故稱膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。

免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold?labelling?techique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測方法中。

膠體金法檢測試劑將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在膜上，膠體金標(biāo)記試劑(抗體或單克隆抗體)吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待檢樣本加到試紙條一端的樣本墊上后，通過毛細(xì)作用向前移動，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動至固定的抗原或抗體的區(qū)域時，待檢物與金標(biāo)試劑的結(jié)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測帶上，可通過肉眼觀察到顯色結(jié)果。該法現(xiàn)已發(fā)展成為診斷試紙條，使用十分方便。

中國專利申請CN101949932A提供了一種膠體金法檢測EB病毒IgA抗體的檢測試劑，其采用EB病毒NA1抗原包被檢測線，鼠抗人IgA單抗標(biāo)記膠體金，用羊抗鼠IgG抗體包被質(zhì)控線。中國專利申請CN102539768A提供了一種EB病毒Zta?IgA抗體膠體金檢測試劑，其采用EB病毒Zta抗原包被檢測線，鼠抗人IgA單抗標(biāo)記膠體金，用羊抗鼠IgG抗體包被質(zhì)控線。

以上兩種膠體金法檢測試劑均采用EB病毒抗原包被檢測線，檢測線的抗原可與檢測樣本中的EB病毒IgG、IgA、IgM等所有抗體反應(yīng)，由于IgG是血清中免疫球蛋白主成分，約占血清中免疫球蛋白總含量的75％，是檢測目標(biāo)IgA抗體的4～7倍，可嚴(yán)重競爭干擾檢測目標(biāo)IgA與包被EB病毒抗原的結(jié)合，造成檢測結(jié)果靈敏度與特異性降低。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的在于提供一種EB病毒VCA-IgA抗體檢測試劑，用鼠抗人IgA單克隆抗體劃檢測線，并引入生物素-親和素系統(tǒng)，直接捕獲檢測樣本中的全部IgA抗體，可以有效的避免IgG、IgM等抗體的干擾，提高檢出的靈敏度與特異性。

本發(fā)明的另一個目的在于提供一種EB病毒VCA-IgA抗體檢測試劑盒。

本發(fā)明還提供所述檢測試劑的制備方法。

根據(jù)本發(fā)明的一方面，一種EB病毒VCA-IgA抗體檢測試劑，至少包括

一反應(yīng)膜，所述反應(yīng)膜上劃有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線含有鼠抗人IgA單克隆抗體；所述質(zhì)控線含有生物素；

一抗原墊，所述抗原墊含有由生物素標(biāo)記的重組EB病毒VCA抗原；

一金標(biāo)墊，所述金標(biāo)墊含有膠體金標(biāo)記的親和素復(fù)合物。