[發明專利]FAS II抑制劑ABX的生物合成基因簇

在審

• 申請號: 201410468972.3
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104263738A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發明（設計）人: 瞿旭東;于明加;鄧子新
• 申請（專利權）人: 武漢大學
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/53;C12N15/52;C12N15/54;C12P17/18
• 代理公司: 武漢科皓知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 42222
• 代理人: 汪俊鋒

1.來自于細菌Streptomyces?sp.?MA6657，和II型芳香聚酮化合物ABX合成相關的基因簇，包括：

1）負責聚酮骨架形成的II型線性聚酮合成酶基因，即abxA、abxB和abxC共3個基因：

編碼酮基合成酶的abxA位于基因簇核苷酸序列第1-1227個堿基處，序列如SEQ?ID?No?2所示；

編碼酮基合成酶的abxB位于基因簇核苷酸序列第1230-2477個堿基處，序列如SEQ?ID?No?4所示；

編碼酰基載體蛋白的abxC位于基因簇核苷酸序列第2514-2753個堿基處，序列如SEQ?ID?No?6所示；

2）負責聚酮骨架成環的基因，即abxD、abxE和abxH共3個基因：

編碼聚酮環化酶的abxD位于基因簇核苷酸序列第2750-3241個堿基處，序列如SEQ?ID?No?8所示；

編碼聚酮環化酶的abxE位于基因簇核苷酸序列第3238-3579個堿基處，序列如SEQ?ID?No?10所示；

編碼酮基還原酶的abxH位于基因簇核苷酸序列第6151-6921個堿基處，序列如SEQ?ID?No?16所示；

3）負責聚酮合成過程中縮酮氧橋基礎骨架手性選擇的基因，即abxJ?基因，位于基因簇核苷酸序列第8173-8901個堿基處，序列如SEQ?ID?No?20所示；

4）負責后修飾的基因，即abxM、abxF和abxI共3個基因：

編碼甲基轉移酶的abxM位于基因簇核苷酸序列第11550-12299個堿基處，序列如SEQ?ID?No?26所示；

編碼鹵化酶的abxF位于基因簇核苷酸序列第3622-4899個堿基處，序列如SEQ?ID?No?12所示；

編碼甲基轉移酶的abxI位于基因簇核苷酸序列第6996-8030個堿基處，序列如SEQ?ID?No?18所示；

5）負責調節的基因，即abxG、abxK和abxL共3個基因：

編碼調控因子的abxG位于基因簇核苷酸序列第4908-6239個堿基處，序列如SEQ?ID?No?14所示；

編碼調控因子的abxK位于基因簇核苷酸序列第8972-10555個堿基處，序列如SEQ?ID?No?22所示；

編碼調控因子的abxL位于基因簇核苷酸序列第10636-11208個堿基處，序列如SEQ?ID?No?24所示。

2.一種使用權利要求1所述基因簇產生ABX化合物的方法，包括如下步驟：

1）首先將Streptomyces?sp.?MA6657來源的原始菌培養到OD值為1提取基因組DNA，通過Sau3AⅠ限制性內切酶對基因組DNA的部分酶切處理，待切到48kb大小DNA片段后對外源片段采用電洗脫的方法進行膠回收，之后將上述48kb大小的DNA目的片段與Hpa?I?和Bam?HI限制性內切酶切處理好的載體pJTU2554連接進行后續的基因文庫的包裝、轉染、效價測定及單菌落挑取并完成陽性Cosmid?4E10的篩選工作，篩選工作涉及到篩選引物ABX-L/R/M/S的確定，最終通過PCR的方法確定ABX化合物合成相關功能基因簇邊界，從而確定ABX化合物合成的關鍵基因簇；所述pJTU2554的改造過程如下：

pSET152通過Xba?I?和Xho?I雙酶切后保留了阿泊拉抗性基因、oriT接合轉移位點區域、attp重組整合位點以及λ噬菌體的整合系統int區域；

pOJ446通過Pst?I酶切后除去原有載體質粒的oriT接合轉移位點區域構建成含有3個cos位點的pJTU2553載體質粒，最后通過Xba?I?和Xho?I雙酶切將3個cos位點區域與之前酶切好的pSET152保留部分連接成最終的pJTU2554改造后質粒；

2）將篩選得到的4E10?Cosmid通過結合轉移異源表達到S.albus宿主菌；

3）挑選該工程菌的單菌落進行培養并且大量發酵，得到了ABX化合物。