[發明專利]兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法

在審

• 申請號: 201410468113.4
• 申請日: 2014-09-16
• 公開（公告）號: CN104232488A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 鞏紅霞;鞏強;傅英文;張祖維;田文霞;賈廣樂;雷宇平;安偉
• 申請（專利權）人: 山西出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心;鞏強
• 主分類號: C12N1/10
• 分類號: C12N1/10;C12N3/00;C12R1/90
• 代理公司: 太原科衛專利事務所(普通合伙) 14100
• 代理人: 朱源;武建云

技術領域

本發明涉及寄生蟲的純化提取方法，具體為一種兔肝球蟲卵囊純化及形成攻擊性子孢子的方法。

背景技術

兔球蟲是家兔最常見的一種寄生蟲，由于其對養兔業危害極大，幼兔感染率高達90％以上，患病幼兔死亡率高達40％～70％。早在1935年我國研究者就開始了兔球蟲種類調查，尤其是解放后眾多學者在全國范圍內開展了兔球蟲種類調查、內生發育史、各階段蟲體的超微結構、細胞化學、球蟲免疫機理等方面的研究。現公開文獻所記載的兔球蟲種類較多，據Levine（1985年）等人的研究確認共有14種，且都為艾美爾屬，除斯氏艾美爾球蟲寄生于兔肝膽管上皮細胞外，其余13種都寄生于腸。目前，國內外對斯氏艾美爾球蟲即兔肝球蟲的研究不多，對它造成的危害性也沒有引起足夠的重視，實用性的研究成果基本上處于零。肝球蟲卵囊在外界環境中有極強的生存能力和抵抗力，卵囊在外界土壤中可生存4-9個月，在有樹蔭的地方可生存15-18個月。一般的消毒藥，如5%福爾馬林、5%石碳酸、5%硫酸銅、10%硫酸、5%氫氧化鉀及5%碘化鉀、2%的來蘇爾、0.2%的新潔爾滅、0.25%麝香草酚對卵囊均無作用，甲醛熏煙無效，由此造成的傳播極其廣泛，且由于不同蟲株的免疫原性沒有交叉性限制了疫苗的研制，使該病預防極為困難。因此，一旦感染則很難清除，給畜牧業經濟造成極大的危害。

經查閱及參考相關外文文獻，發現僅有一篇關于Eimeria?tenella的子孢子純化過程，即用胰蛋白酶牛黃膽酸鈉進行脫囊，隨后按文獻記載的方法進行還原，但沒有成功，更沒有出現文獻報道的形成子孢子。

概括其步驟如下：

A、用5%的次氯酸鈉分離純化后的艾美爾球蟲卵囊，卵囊壁為兩層，薄的淺色內層和厚的亮色外層，內層顏色較淺并清晰。

B、用0.4%胃蛋白酶/HCl室溫培養2h后卵囊壁變皺接近孢子囊。

C、分離艾美爾球蟲的卵囊，0.4%胰蛋白酶/0.75%牛磺膽酸液在40℃條件下孵育2.5h，卵囊壁破裂，孢子囊開始向外擠出。

D、脫離卵囊壁的孢子囊和卵囊壁的碎片在0.75%牛磺膽酸液中繼續40℃孵育2h。

E、子孢子在RPMI培養基中40℃孵育10h；具體步驟如下：

步驟1：培養基0.4%的胃蛋白酶用蒸餾水配制，用1N的HCl調節pH至3，孵育10⁶卵囊/10ml，0.4%胃蛋白酶在40℃，5%CO₂培養箱中培養2h，用PBS（1100g，10min）洗2次。

步驟2：培養基A液，0.4%胰蛋白酶/0.75%牛磺膽酸液，用RPMI為基質配制孵育，10⁶卵囊/10ml，0.4%A液在40℃恒溫振蕩器（180rpm）中培養2h，釋放出的孢子囊達30-40%。用PBS（1100g，10min）洗2次。

步驟3：培養基B液，0.75%牛磺膽酸液，2.5mM的MgCl₂用RPMI為基質配制孵育：10⁶卵囊/10ml，B液在40℃，5%?CO₂培養箱中培養2h用PBS（1100g，10min）洗2次。

步驟4：培養基RPMI加1%的胎牛血清，孵育40℃，5%CO₂培養箱中培養6-10h。

上述所有步驟必須進行無菌操作。

發明內容

本發明的目的在于從注冊場的兔廠中分離提純斯氏艾美爾肝球蟲的純卵囊及形成攻擊性子孢子。

本發明是采用如下技術方案實現的：

一種兔肝球蟲卵囊純化的方法，包括如下步驟：

（1）、從感染兔肝球蟲的兔子肝臟中將白色病變結節挑出于研磨容器中并加生理鹽水；

（2）、將白色病變結節研磨；

（3）、過濾于容器內；

（4）、將收集的濾液分裝于多個離心管中，離心后棄上清；然后將沉淀懸浮于水中，重復此步驟一次；

（5）、將沉淀溶于飽和NaCl溶液中，加水后離心，吸取表面的糊狀物及上清液于另一容器內，加水稀釋收集液，再次離心后棄上清；重復此步驟一次；

（6）、在沉淀中加入重鉻酸鉀溶液，25-40℃下搖床培養2-6天，即可得到純化后的肝球蟲卵囊。

優選的，上述步驟（4）中，離心參數為：2000-4000r/min離心5-15min。

步驟（5）中，首次離心參數為：500-1500r/min離心4-10min；再次離心參數為：3000-5000r/min離心5-15min。