[發(fā)明專利]家蠶谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410467980.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-15
• 公開（公告）號(hào): CN104293807A
• 公開（公告）日: 2015-01-21
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余泉友;周磊;張澤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/54
• 分類號(hào): C12N15/54;C12N9/10;A01N63/02;A01P7/04
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，主要是鱗翅目害蟲防治和家蠶抗藥性品種改良領(lǐng)域。

背景技術(shù)

谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(Glutathione?S-transferase,GSTs,EC?2.5.1.18)是一類重要的同工酶超家族，廣泛分布于動(dòng)物、植物、酵母、細(xì)菌等生物體中，具有對(duì)內(nèi)源和外源性有毒物質(zhì)解毒的功能。在昆蟲體內(nèi)它不但行使對(duì)有機(jī)磷、有機(jī)氯和擬除蟲菊酯類殺蟲劑的解毒，而且也具有消除昆蟲體內(nèi)因殺蟲劑等因素引起的的脂質(zhì)過氧化物，保持體內(nèi)的氧化與抗氧化的動(dòng)態(tài)平衡。

殺蟲劑在害蟲防治中起著非常重要的作用，但是隨著大量農(nóng)藥的使用，昆蟲抗藥性日益加劇，迫使人們加大藥劑的用量，這不但制約了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，也給環(huán)境帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)，影響到了經(jīng)濟(jì)和人類的可持續(xù)性發(fā)展。GSTs作為昆蟲重要的解毒酶系，已有少許研究鑒定了GSTs基因在殺蟲劑抗性中的作用，但因殺蟲劑靶標(biāo)有限嚴(yán)重制約了新型高效殺蟲劑的研發(fā)。家蠶作為鱗翅目的模式昆蟲，而且也是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲。我們以殺蟲劑連續(xù)多代篩選的家蠶為材料，克隆獲得一個(gè)在篩選品系中高表達(dá)的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶BmGSTe2基因。通過體外表達(dá)的酶活性鑒定，殺蟲劑體外抑制酶活性及組織表達(dá)定位等研究，證實(shí)該基因與家蠶殺蟲劑抗性相關(guān)。通過這一基因靶點(diǎn)，有望設(shè)計(jì)出防治鱗翅目害蟲的藥物，并用于家蠶抗藥性品種的分子改良。因此，在農(nóng)林害蟲的防治和品種改良中有著重要的理論和實(shí)踐意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是利用了生物信息學(xué)，分子和細(xì)胞生物學(xué)方法，證實(shí)了BmGSTE2具有體外代謝CDNB(1-氯-2,4-二硝基苯)和CHP(過氧化氫異丙苯)的活性，并與殺蟲劑相互作用的功能。目的在于以此為靶點(diǎn)開發(fā)新的殺蟲劑藥物及改良家蠶抗藥性品種。

本發(fā)明申請(qǐng)人用2種殺蟲劑對(duì)家蠶分別進(jìn)行多代連續(xù)篩選，獲得耐藥性品系后，利用RT-PCR發(fā)現(xiàn)BmGSTe2基因的表達(dá)水平在經(jīng)篩選后的家蠶中顯著提升。通過對(duì)BmGSTe2進(jìn)行克隆和異源表達(dá)，獲得BmGSTE2重組蛋白，對(duì)其進(jìn)行酶特性和活性分析；同時(shí)制備了多克隆抗體，經(jīng)免疫印跡和免疫組化鑒定了BmGSTE2蛋白的組織表達(dá)和細(xì)胞分布情況。結(jié)果證實(shí)BmGSTE2的高表達(dá)是增強(qiáng)家蠶耐藥性的原因之一。

本發(fā)明的家蠶抗藥性基因BmGSTe2通過以下步驟獲得和證實(shí)：

(1)BmGSTe2與家蠶耐藥性的初步鑒定

以甲氰菊酯(fenpropathrin)和辛硫磷(phoxim)分別對(duì)家蠶19-440品系(F₀)進(jìn)行4代和5代篩選，并標(biāo)記為F₄和F₅品系。經(jīng)篩選后F₄對(duì)甲氰菊酯的致死中濃度(LD₅₀)為F₀的4.2倍，F(xiàn)₅對(duì)辛硫磷的LD₅₀為F₀的1.8倍，表明殺蟲劑篩選顯著提高了家蠶耐藥性。本實(shí)驗(yàn)以添加殺蟲劑的桑葉喂食家蠶用于篩選，分離出F₀，F(xiàn)₄和F₅品系雌雄個(gè)體的中腸，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄cDNA。下載NCBI中其他昆蟲GST蛋白序列，與家蠶基因組進(jìn)行同源比對(duì)，獲得家蠶GST基因序列。并利用RT-PCR方法鑒定家蠶GST家族基因在篩選前后的表達(dá)變化。結(jié)果表明BmGSTe2的表達(dá)較篩選前有顯著提高(圖1)，暗示BmGSTe2與篩選后家蠶的耐藥性形成相關(guān)。

(2)BmGSTe2的克隆與序列分析

BmGSTe2的克隆：提取家蠶中腸組織的總RNA并反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以BmGSTe2特異引物(正向：5'-GGATCCATGTCTATAATTATTTACCAAACAT-3'，反向：5'-GCGGCCGCGACAGGAAAGCAATTCAATAGTT-3'，下劃線分別為限制性內(nèi)切酶NdeI和BamHI酶切位點(diǎn))進(jìn)行PCR擴(kuò)增。膠回收純化擴(kuò)增獲得的BmGSTe2DNA片段，以NdeI和BamHI雙酶切并回收目的產(chǎn)物，與酶切后的pET-28a載體經(jīng)T4連接酶連接構(gòu)建重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，獲得陽(yáng)性克隆后送往上海生工生物工程公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果表明擴(kuò)增的序列與預(yù)期的結(jié)果一致。