[發(fā)明專利]一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410467839.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104263645A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 鐘巧芳;程在全;李維蛟;張敦宇;殷富有;李定琴;余騰瓊;柯學(xué);肖素勤;陳玲;陳越;付堅(jiān);王玲仙;蔣聰;王波;曾民;李娥賢;羅紅梅;蔣春苗;黃興奇
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所
• 主分類號(hào): C12M1/42
• 分類號(hào): C12M1/42
• 代理公司: 昆明合眾智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 53113
• 代理人: 康珉

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種水稻真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置，屬于基因工程和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

水稻是全球一半以上人口主要的糧食作物，然而，水稻生產(chǎn)受到越來(lái)越多不利因素（如病蟲(chóng)害等）的限制，因此水稻品種的改良十分迫切。轉(zhuǎn)基因技術(shù)能突破生物種間障礙，實(shí)現(xiàn)物種間基因的轉(zhuǎn)移，從而為作物遺傳改良提供新途徑。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)對(duì)水稻進(jìn)行遺傳改良的成功與否，很大程度上依賴于有效的遺傳轉(zhuǎn)化方法的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用。現(xiàn)在，公知的水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法一般分為2類：一類是直接的基因轉(zhuǎn)化（包括基因槍法、電擊法、PEG法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)化法和花粉管通道法等），這類方法往往因?yàn)槌杀靖撸僮骷夹g(shù)繁瑣而極少應(yīng)用；另一類是由載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，目前應(yīng)用較為廣泛的是農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，利用該方法在水稻上已成功獲得一些具有抗病蟲(chóng)害、抗逆等優(yōu)異性狀的轉(zhuǎn)基因材料。

然而傳統(tǒng)的農(nóng)桿菌介導(dǎo)法明顯地存在許多不足：轉(zhuǎn)化的實(shí)現(xiàn)必須經(jīng)過(guò)對(duì)成熟種胚等外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)、胚性愈傷繼代、愈傷與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)、抗性愈傷篩選及抗性愈傷分化出苗等至少近4個(gè)月的組織培養(yǎng)過(guò)程，轉(zhuǎn)化操作繁瑣且周期長(zhǎng)，人財(cái)物花費(fèi)大，而且對(duì)操作者的技術(shù)要求高；其次在近4個(gè)月的組織培養(yǎng)過(guò)程中，易發(fā)生體細(xì)胞變異、形態(tài)畸形、染色體數(shù)目改變和育性喪失等問(wèn)題，造成遺傳背景復(fù)雜化；再者得到的轉(zhuǎn)化植株常出現(xiàn)基因沉默，轉(zhuǎn)化效率低。因此，開(kāi)發(fā)一種無(wú)需經(jīng)過(guò)組培過(guò)程，具有簡(jiǎn)便、快速和高效等優(yōu)勢(shì)，只需對(duì)開(kāi)花前的活體植株短暫真空處理即實(shí)現(xiàn)外源基因向植株轉(zhuǎn)化的水稻真空滲透轉(zhuǎn)化裝置和方法，便成為水稻基因轉(zhuǎn)化的另一重要途徑。

盡管目前有關(guān)真空滲透轉(zhuǎn)化法成功應(yīng)用的研究報(bào)道很多，但基本只局限在擬南芥、芥菜、白菜、菜薹、甘藍(lán)型油菜、蘿卜、煙草等個(gè)體較小的植物上應(yīng)用，而且轉(zhuǎn)化率偏低，真正獲得的有應(yīng)用價(jià)值的轉(zhuǎn)基因植物較少。現(xiàn)有的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化大多是用現(xiàn)成的、體積較小的真空干燥器（如圖14所示）作為真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置，其基本操作是：將滲透轉(zhuǎn)化液倒入真空干燥器，除擬南芥用活體植株進(jìn)行轉(zhuǎn)化外，其余植物（如芥菜、白菜、菜薹、甘藍(lán)型油菜、蘿卜、煙草等）均是將待轉(zhuǎn)化植株直接從培養(yǎng)缽中拔出、洗凈后，先將待轉(zhuǎn)化植株全株或部分浸泡在真空干燥器中的滲透轉(zhuǎn)化液中，此時(shí)真空干燥器處于常壓狀態(tài)，然而植株已浸泡在滲透轉(zhuǎn)化液中開(kāi)始了滲透遺傳轉(zhuǎn)化，然后再用真空泵減壓使真空干燥器達(dá)到真空狀態(tài)，繼續(xù)在真空狀態(tài)下滲透遺傳轉(zhuǎn)化（即真空處理），達(dá)到預(yù)定時(shí)間后（即完成滲透遺傳轉(zhuǎn)化），關(guān)閉真空泵開(kāi)關(guān)，打開(kāi)真空干燥器通氣閥門(mén)，待恢復(fù)常壓后,揭開(kāi)干燥器蓋，取出植株種植在培養(yǎng)缽中或田間。擬南芥真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化不同的是，由于擬南芥植株較小（20-30cm）,一般是在真空干燥器中放置裝有滲透轉(zhuǎn)化液的燒杯，然后將種植在營(yíng)養(yǎng)缽里的擬南芥活體植株連同營(yíng)養(yǎng)缽一起倒置浸入在燒杯中，然后如上所述進(jìn)行真空滲透轉(zhuǎn)化。現(xiàn)有的真空滲透轉(zhuǎn)化裝置存在以下不足：（1）采用現(xiàn)有的真空干燥器進(jìn)行的真空滲透轉(zhuǎn)化，在抽真空減壓之前，植株已經(jīng)浸泡在容器內(nèi)的農(nóng)桿菌滲透液（滲透液）中，雖然容器內(nèi)的植株和滲透液還處于常壓狀態(tài)，但是植株浸泡在容器內(nèi)的農(nóng)桿菌滲透液中已經(jīng)開(kāi)始了遺傳轉(zhuǎn)化，其轉(zhuǎn)化過(guò)程可以說(shuō)包含了部分常壓下的滲透轉(zhuǎn)化和部分真空的滲透轉(zhuǎn)化，并沒(méi)有真正實(shí)現(xiàn)真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，其農(nóng)桿菌對(duì)植株的侵染力降低，轉(zhuǎn)化效率也隨之降低。這可能也是目前真空滲透轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化效率偏低的主要原因。（2）現(xiàn)有的真空干燥器由于受體積較小、沒(méi)有適宜活體植物放置的相應(yīng)配套部件以及操作不方便等因素限制，使水稻、花卉、棉花、麥類等個(gè)體較大作物不能實(shí)現(xiàn)在原種植條件的活體狀態(tài)（即原位條件）下進(jìn)行滲透遺傳轉(zhuǎn)化，多采用將受體植株挖出，將其直接倒放于容器中進(jìn)行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后又移栽的操作方式，一方面并不是真正的原位轉(zhuǎn)化，另一方面對(duì)轉(zhuǎn)化后植株的生長(zhǎng)狀態(tài)、健壯程度和結(jié)實(shí)率均有影響，進(jìn)而造成真空滲透轉(zhuǎn)化效率偏低。（3）即便像擬南芥這樣小的活體植株的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化操作，也存在許多側(cè)枝被壓斷，導(dǎo)致處理轉(zhuǎn)化效果低的問(wèn)題。綜上所述，現(xiàn)有的真空滲透轉(zhuǎn)化裝置及其轉(zhuǎn)化方法并不適于水稻等作物的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化，因此設(shè)計(jì)和開(kāi)發(fā)出一種操作簡(jiǎn)便、快速和高效的適于水稻等作物的真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置，這將極大地縮短轉(zhuǎn)化周期、節(jié)約科研成本，提高轉(zhuǎn)化效率，為作物品種的遺傳改良和基因功能研究提供強(qiáng)有力的技術(shù)保障。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化裝置未真正在真空狀態(tài)下實(shí)現(xiàn)滲透遺傳轉(zhuǎn)化和不適于水稻等個(gè)體較大作物的不足，本發(fā)明提供一種真正在真空狀態(tài)下、操作簡(jiǎn)便、對(duì)水稻實(shí)現(xiàn)原位真空滲透遺傳轉(zhuǎn)化的裝置。