[發明專利]茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1及其應用

有效

• 申請號: 201410467727.0
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104195120A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 朱聞君;汪琪;趙小龍;湯進;陳平;楊濤;張紹鵬;李長玲;鄧琛
• 申請（專利權）人: 朱聞君;汪琪;趙小龍;湯進;陳平;張紹鵬;楊濤;李長玲;鄧琛;霍夢蕊
• 主分類號: C12N9/12
• 分類號: C12N9/12;C12N15/54;C12N15/63;C12N1/15
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術領域

本發明屬于生物技術領域，主要涉及用轉錄組數據克隆茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk?1(PcWSmk)，及其編碼產物與應用。

背景技術

藥用茯苓是指多孔菌科真菌茯苓(Poria?cocos(Schw.)Wolf)的菌核，它是我國常用的大眾藥材品種之一，具有極高的藥用價值和膳食營養價值，入藥能夠利水滲濕、益脾和胃、寧心安神。由于茯苓特殊的生態習性，其菌核的生長發育主要依賴于對松木的寄生并吸取其中的碳源、氮源以及其它一些必需的物質，為探索不依賴松木資源的新栽培技術、精準調控菌核形成條件及提高產量，研究茯苓菌核形成相關基因的功能及作用機理具有重要意義。

絲裂原活化蛋白質激酶(mitogen-activated?protein?kinase，MAPK)是絲/蘇氨酸蛋白質激酶的一個大家族，廣泛存在于真核生物中。真核生物的MAPK通路由三級激酶組成，通過級聯反應將信號不斷放大并傳遞下去，MAPK是該級聯途徑的最后一個激酶，既可以作為信號轉導的一個環節繼續磷酸化下游的成分，又可以進入細胞核激活轉錄因子進而調節基因表達，在信號轉導中的作用非常重要。MAPK信號轉導途徑在植物病原真菌的生長、發育和致病性調節方面占有非常重要的地位。PcWSmk基因屬于MAPK信號通路中的一個基因，在菌核形成起始階段的表達量達到最高，PcWSmk基因沉默菌株不能形成成熟的菌核。

本申請首次利用第二代Solexa?HiSeq2000進行茯苓的轉錄組測序及De?novo拼接。分析找到茯苓中編碼MAPK的候選基因并進行體外克隆表達，將其通過轉基因技術在茯苓中過表達，發現其可加快茯苓菌核的形成及提高產量。

在本發明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的PcWSmk基因及其氨基酸序列。此基因編碼的酶在茯苓菌核形成過程中有重要的作用。

發明內容

本發明的目的在于提供一種茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1(PcWSmk)，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。Smk1在菌核形成過程中具有必不可少的作用，該基因能夠加快茯苓菌核的形成。

本發明另一個目的是提供Smk1基因編碼的蛋白質，其序列為SEQ?ID?NO.2所示。

本發明的最后一個目的在于提供一種茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1(PcWSmk)在加快茯苓菌核形成中的應用，還包括增加藥用茯苓產量中的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：

一種茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1(PcWSmk)(以下或稱PcWSmk基因)，其制備方法如下：

以茯苓的cDNA作為模板，設計引物P1：5'ATGGAAGACCGAGCAGCGGCGACAA3'；P2：5'TCATTGAGGCCGAGGGCGCGTCACT3'進行PCR擴增，PCR條件如下：

3min,95℃；30s?94℃；and?30s?57℃,1min?72℃?35個循環；10min,72℃；1min,25℃。

最終獲得了PcWSmk基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示，編碼的蛋白質為SEQ?ID?N?O.2所示。

一種茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1(PcWSmk)在加快茯苓菌核形成(提高菌核產量)中的應用，其應用過程如下：

將茯苓MAPK蛋白(SEQ?ID?NO.2所示氨基酸)對應的基因(優選SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列)通過PEG介導的遺傳轉化轉入茯苓原生質中，然后按常規方式進行茯苓的接種及栽培，可獲得高產茯苓菌核的轉基因茯苓。

本發明的所要保護的內容還包括：

編碼SEQ?ID?NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；優選SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

含有本發明的茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1(PcWSmk)或其ORF序列的的重組載體，如原核類載體，真核類表達載體及RNAi載體均屬于本發明的保護范圍，包括但不限于pRS314載體，PE×p3300，pBARGPE1,pAN7-1,pAN52-1,pBC-hygro。

含有本發明的茯苓MAPK蛋白編碼基因Smk1(PcWSmk)全序列或其ORF序列的宿主細胞，如含有上述的重組載體的宿主細胞也屬于本發明的保護范圍，包括但不限于大腸桿菌細胞、農桿菌細胞EA101,EA105,LBA4404、畢赤酵母。