[發(fā)明專利]熒光定量PCR檢測豬呼吸繁殖障礙疾病相關(guān)病毒試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410465637.8
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104263852A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 姜永厚;吳海港;饒品彬
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江理工大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12R1/93
• 代理公司: 杭州中成專利事務(wù)所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種四重檢測豬圓環(huán)病毒2型、豬細小病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的實時熒光定量PCR試劑盒。

背景技術(shù)

目前我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)正在迅速發(fā)展，不同地區(qū)、不同規(guī)模豬場的養(yǎng)豬水平差異很大。豬群的健康狀況與生產(chǎn)水平息息相關(guān)。豬病對于生產(chǎn)水平的影響首先表現(xiàn)在引起豬只的直接死亡，導致豬的成活率降低。即使沒有導致豬群的死亡，其健康狀況也會因發(fā)病而受到影響，使豬群的生長發(fā)育受阻，嚴重影響了肉豬及種豬的質(zhì)量。其次，我國養(yǎng)豬業(yè)正經(jīng)歷由散養(yǎng)型向規(guī)模化、集約化方向發(fā)展，豬場規(guī)模不斷擴大，養(yǎng)豬密度逐漸集中，使得一些傳染性疾病在豬群中的流行速度加大，豬病的危害程度日益提高，這些都給豬場防疫工作帶來了挑戰(zhàn)。對于一個豬場來說，一旦因防疫工作不到位而發(fā)生烈性傳染病，將會給養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)帶來巨大的損失。現(xiàn)階段我國豬傳染病流行的主要特征是：多種病原混合感染，繁殖障礙性傳染病和呼吸傳染病普遍存在，而豬圓環(huán)病毒2型，豬細小病毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒這4種病毒的感染和交叉感染在豬繁殖障礙疾病和豬呼吸道疾病的發(fā)生和流行中扮演著重要角色。

豬圓環(huán)病毒(Porcine?circovirus，PCV)是一種小的無包膜病毒，含有一個1.76kb左右的單鏈環(huán)狀DNA基因組，是環(huán)病毒科、圓環(huán)病毒屬成員。PCV具有PCV1和PCV2兩種基因型。PCV1可污染PK15細胞系，是一種非致病性病毒；PCV2有致病性，可引起豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)、豬呼吸道傳染疾病、豬繁殖系統(tǒng)障礙等疾病。豬是PCV2的天然宿主，以哺乳期和育成期的豬最易感染此病。流行病學調(diào)查表明，豬圓環(huán)病毒在世界各國的豬群中廣泛存在，在臨床上易于與豬呼吸與繁殖綜合征病毒(PRRSV)，豬細小病毒(PPV)等其他病原混合感染，表現(xiàn)出多種臨床癥狀和病理變化。

豬細小病毒(Porcine?parvovirus，PPV)屬于細小病毒科、細小病毒屬，其基因組是一條長約5000bp的單股負鏈DNA，能自我復制，包含兩個主要的閱讀框。它能引起母豬的繁殖障礙，該病在1967年發(fā)現(xiàn)于英國，目前世界各個國家均有發(fā)現(xiàn)。PPV感染導致的臨床癥狀為胚胎和胎兒死亡、母豬流產(chǎn)、死胎和木乃伊胎等。目前，對PPV的研究主要集中于病原學、理化性質(zhì)和防制等方面，由于PRRSV、CSFV等也能引起母豬繁殖障礙疾病，這些傳染病與PPV感染難以區(qū)別診斷，給PPV的防治帶來了一定的困難。

1987年在美國和加拿大首次發(fā)現(xiàn)豬繁殖與呼吸綜合癥，隨后幾年流行于歐洲各國。現(xiàn)在本病一直廣泛存在和流行于世界各主要養(yǎng)豬國家。臨床表現(xiàn)為母豬繁殖障礙，呈現(xiàn)流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎及仔豬咳嗽、肺炎等病癥。豬繁殖與呼吸綜合癥是由豬繁殖與呼吸綜合癥病毒(Porcine?reproductive?and?respiratory?syndrome?virus，PRRSV)引起的，根據(jù)遺傳學、臨床癥狀及病理學的差異分為美洲型(US)和歐洲型(EU)分離株，這兩種株型有55-70％的同源性。目前，我國分離獲得的毒株大多數(shù)為美洲型。

豬瘟是由豬瘟病毒(Classical?swine?fever?virus，CSFV)屬于黃病毒科、瘟病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，長約12.3kb，含有一個大的開放式閱讀框(ORF)，編碼3898個氨基酸，最終產(chǎn)生11-12種多肽。可引起的一種接觸性傳染病，導致母豬流產(chǎn)，胎兒木乃伊、畸形，死產(chǎn)等癥狀。豬瘟的高致病率和高死亡率給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失，近十年來它的流行和發(fā)病特點發(fā)生很大變化,臨床癥狀缺乏規(guī)律。

以上4種病原均可不同程度地引起豬繁殖性障礙，并且常常混合感染。僅憑臨床癥狀、病理變化、流行病學調(diào)查很難作出準確診斷，尤其是在發(fā)病的早期或潛伏期診斷更加困難。因此，建立一種特異性強、靈敏度高、重復性好、能同時檢測多種病原的檢測方法和檢測試劑盒對豬呼吸和繁殖障礙疾病的診斷和防治具有重要意義。

隨著各種分子生物學技術(shù)的飛速發(fā)展及其在醫(yī)學研究中的廣泛應(yīng)用，特別是最近幾年興起的熒光定量PCR技術(shù)，實時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied?Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。因此，建立關(guān)于豬圓環(huán)病毒2型，豬細小病毒，豬繁殖與呼吸綜合征病毒和豬瘟病毒的多重熒光定量RT-PCR的分子生物學快速，特異性強，靈敏度高，無污染的基因檢測方法和診斷試劑盒尤為重要。

發(fā)明內(nèi)容