[發明專利]檢測口蹄疫A型、O型和Asia 1型病毒的試劑盒及制備方法

有效

• 申請號: 201410464443.6
• 申請日: 2014-09-15
• 公開（公告）號: CN104195268A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 張強;盧昌;趙志荀;吳國華;顏新敏;李應國;岳華;周曉黎;李健;朱海霞
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 蘭州振華專利代理有限責任公司 62102
• 代理人: 張晉

技術領域

本發明涉及一種可用于檢測口蹄疫A型、O型和Asia?1型病毒的引物，由包括有這一引物的試劑盒及制備方法。

背景技術

口蹄疫（Foot-and-mouth?disease，FMD）是由口蹄疫病毒（Foot-and-mouth?disease?virus,?FMDV）引起的動物急性、烈性傳染病，主要危害豬、牛、羊痘偶蹄動物，發病率極高，造成了巨大的政治、經濟損失，因此被世界衛生組織（OIE）列為A類傳染病的首位。FMDV可以分為7個血清型，即A型、O型、C型、Asia?1型、SAT?1型、SAT?2型和SAT?3型，每個血清又有許多不同的亞型，且各血清型之間沒有交叉性免疫，同一血清型的各亞型之間僅有部分交叉免疫。

由于快速鑒別診斷結果有利于特定型疫苗的選擇和控制疫病蔓延，口蹄疫病毒的分型鑒別診斷一直是研究的熱點。由于口蹄疫各血清型之間沒有交叉保護，同一血清型的各亞型之間僅有部分交叉免疫，這使得口蹄疫的診斷和控制更加困難。補體結合試驗曾被用于口蹄疫診斷和病毒分型，直到1970s該方法仍在一些流行病地區使用，但是該方法的靈敏度比較低。Roeder?和Le?Blanc?Smith通過使用兔和豚鼠抗純化146S口蹄疫病毒顆粒高滴度抗血清的ELISA方法成功地檢測了口蹄疫病毒抗原。該方法的靈敏度比補體結合試驗高125倍，并且被用作常規口蹄疫的診斷和病毒分型。但是ELISA方法檢測含病毒的上皮懸浮液只有約70-80％陽性結果，因此病毒必須在組織培養中進行增殖后，再通過ELISA中進行檢測和血清型分型。基于單抗的ELISA也被開發用于口蹄疫的診斷和病毒分型(Chen,?H,?et?al.,2012;?Morioka?K,?et?al.,2009)。最近，有人研發了基礎整聯蛋白ανβ6和血清特異性單克隆抗體的夾心ELISA方法，并將該方法與普通的多克隆抗體夾心ELISA方法進行了比較。整合蛋白/單克隆抗體的ELISA可以識別FMDV的多種抗原和不同的血清型，雖然該方法在同一靈敏度的條件下比常規的多克隆ELISA具有更高的特異性，但是仍然有一些FMDVs不能被檢測出來，(Ferris?NP,?et?al.,2011)。

由于RT-PCR快速，靈敏和可靠性的優點，該方法已被廣泛地用于口蹄疫診斷。近年來各種RT-PCR檢測方法已用于早期上皮細胞，細胞培養分離和其組織中口蹄疫病毒RNA的檢測(Meyer?RF,?et?al.,1991)。Rodriguez等首次可通過RT-PCR對口蹄疫病毒O型、A型和C型進行分型檢測(Rodríguez?A,?et?al.,1992)。自此以后不同血清型特異性引物RT-PCR方法已被用于口蹄疫病毒7個血清型份分型檢測(Callens,?et?al.,1997;?Vangrysperre,?et?al.,1996)。這些檢測引物位于口蹄疫病毒基因組的不同位置，包括5'非編碼區、開放閱讀框和3'端非編碼區。為了提高RT-PCR診斷靈敏度，多組引物結合的多重檢測也被用于口蹄疫的檢測(Giridharan?P,?et?al.,2005;?Bao?H,?et?al.,2008)，但是這些RT-PCR方法的靈敏度依然有限，若前期再結合ELISA方法一起使用必然會使該過程更加耗時費力。