[發明專利]一種碗蕨懸浮細胞培養的快速繁殖方法

在審

• 申請號: 201410463013.2
• 申請日: 2014-09-12
• 公開（公告）號: CN104170746A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 楊存
• 申請（專利權）人: 南京通澤農業科技有限公司
• 主分類號: A01H4/00
• 分類號: A01H4/00
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明涉及碗蕨懸浮細胞培養的快繁方法，屬于植物技術領域。

背景技術

碗蕨，Dennstaedtia?scabra?(Wall.?ex?Hook.)?T.?Moore，碗蕨科，莖紅棕色橫走，紅棕色，密被棕色透明的節狀毛，葉疏生；柄長20-35厘米，粗2-3毫米，紅棕色或淡栗色，稍有光澤，葉片長20-29-(50)厘米，寬15-20厘米，三角狀披針形或長圓形，下部3-4回羽狀深裂，中部以上三回羽狀深裂，孢子囊群圓形，位于裂片的小脈頂端；囊群蓋碗形，灰綠色，略有毛。分布于臺灣、廣西、貴州、云南、四川、湖南、江西和浙江；尼泊爾，印度，印度支那，日本也有。生林下或溪邊，海拔1000-2400米，目前莢果蕨的利用采取野生采集，關于其懸浮細胞的研究更無報道。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是提供一種碗蕨懸浮細胞的快速繁殖方法，由該方法所制備得到的碗蕨懸浮細胞增殖率高，生長周期短，遺傳穩定性好，為碗蕨藥用次生代謝產物的開發和利用提供新的途徑。

本發明所要解決的技術問題是通過以下方案來實現的：

取碗蕨幼嫩葉片，在漂白粉中浸泡2min，流水沖洗12min，水流不宜過大，超凈工作臺上0.1%氯化汞處理7min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的葉片接種入N6+KT1mg/L+2,4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培養基中進行愈傷組織誘導，附加6.5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗室培養，溫度20℃，誘導出來的碗蕨愈傷組織接入N6+KT1mg/L+2,4-D1mg/L進行愈傷組織繼代增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，pH5.8，光照1500lx，溫度20℃，增殖后的愈傷組織篩選長勢穩定均一的愈傷組織0.5g，接種入液體培養基6,7-V+?NAA0.1-0.2mg/L+6-BA0.1-0.2mg/L+Zn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺0.5-2mmol/L中進行懸浮振蕩培養，采用攪拌通氣式設備，溫度22℃，每60ml細胞懸浮液裝入250ml錐形瓶中，4-5周后取出，烘干。

采用本發明制備的碗蕨懸浮細胞增殖率高，生長周期短，產量大，能耗少，利于大規模生產。

下面將結合具體實施方式對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的范圍并不局限于下列實施方式。

具體實施方式

實施例1

取碗蕨幼嫩葉片，在漂白粉中浸泡2min，流水沖洗12min，水流不宜過大，超凈工作臺上0.1%氯化汞處理7min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的葉片接種入N6+KT1mg/L+2,4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培養基中進行愈傷組織誘導，附加6.5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗室培養，溫度20℃，誘導出來的碗蕨愈傷組織接入N6+KT1mg/L+2,4-D1mg/L進行愈傷組織繼代增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，pH5.8，光照1500lx，溫度20℃，增殖后的愈傷組織篩選長勢穩定均一的愈傷組織0.5g，接種入液體培養基6,7-V+?NAA0.1mg/L+6-BA0.1mg/L+Zn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺0.5mmol/L中進行懸浮振蕩培養，采用攪拌通氣式設備，溫度22℃，每60ml細胞懸浮液裝入250ml錐形瓶中，4-5周后取出，烘干，成活率89%。

實施例2

取碗蕨幼嫩葉片，在漂白粉中浸泡2min，流水沖洗12min，水流不宜過大，超凈工作臺上0.1%氯化汞處理7min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的葉片接種入N6+KT1mg/L+2,4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培養基中進行愈傷組織誘導，附加6.5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗室培養，溫度20℃，誘導出來的碗蕨愈傷組織接入N6+KT1mg/L+2,4-D1mg/L進行愈傷組織繼代增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，pH5.8，光照1500lx，溫度20℃，增殖后的愈傷組織篩選長勢穩定均一的愈傷組織0.5g，接種入液體培養基6,7-V+?NAA0.2mg/L+6-BA0.2mg/L+Zn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺2mmol/L中進行懸浮振蕩培養，采用攪拌通氣式設備，溫度22℃，每60ml細胞懸浮液裝入250ml錐形瓶中，4-5周后取出，烘干，成活率88%。

實施例3

取碗蕨幼嫩葉片，在漂白粉中浸泡2min，流水沖洗12min，水流不宜過大，超凈工作臺上0.1%氯化汞處理7min，無菌水沖洗5遍，消毒處理過的葉片接種入N6+KT1mg/L+2,4-D2mg/L+0.5g/L活性炭培養基中進行愈傷組織誘導，附加6.5g/L瓊脂，30g/L蔗糖，暗室培養，溫度20℃，誘導出來的碗蕨愈傷組織接入N6+KT1mg/L+2,4-D1mg/L進行愈傷組織繼代增殖培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂6.5g/L，pH5.8，光照1500lx，溫度20℃，增殖后的愈傷組織篩選長勢穩定均一的愈傷組織0.5g，接種入液體培養基6,7-V+?NAA0.2mg/L+6-BA0.2mg/L+Zn²⁺，Ca²⁺，Mg²⁺0.5mmol/L中進行懸浮振蕩培養，采用攪拌通氣式設備，溫度22℃，每60ml細胞懸浮液裝入250ml錐形瓶中，4-5周后取出，烘干，成活率90%。