[發明專利]可定植動物腸道的熒光標記大腸桿菌及其制備方法

在審

• 申請號: 201410462647.6
• 申請日: 2014-09-11
• 公開（公告）號: CN105462906A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 陳聲;郭九標;林大川;黃浩賢
• 申請（專利權）人: 香港理工大學深圳研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/63;C12R1/19
• 代理公司: 深圳中一專利商標事務所 44237
• 代理人: 張全文

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一種可定植動物腸道的熒光標記 大腸桿菌及其制備方法。

背景技術

在生物學領域，為了便于跟蹤研究，熒光標記方式是最常用的一種。傳統 的熒光分子在發光的同時，會產生具有毒性的氧自由基，導致被觀察的細胞死 亡，這叫做“光毒性”，因此大多只能通過熒光標記來研究死亡細胞靜態結構， 而無直接跟蹤進行活體動態的研究。

相比傳統的熒光標記，綠色熒光蛋白(greenfluorescentprotein)在一種學名 Aequoreavictoria的水母中發現，其基因所產生的蛋白質，在藍色波長范圍的光 線激發下，會發出綠色螢光，且“光毒性”非常弱；所以此后在生物分子學領 域綠色熒光蛋白基因常被用作為一個報導基因使用；現在可供選擇利用的綠色 熒光蛋白的突變體或衍生物有增強型綠色熒光蛋白(EGFP)，藍色熒光蛋白 (EBFP)和黃色熒光蛋白(YFP)等等。

但是包含綠色熒光蛋白基因的重組受體，一般較難與原始狀態下活體組織 的原始細胞競爭。比如，利用載體重組技術標記模式大腸桿菌，如DH5α和TG-1 等非常簡單，但該模式大腸桿菌是經過人工改造過的，第一無法定植到動物腸 道內，第二因為需要進行重組表達而使代謝能力降低，所以無法和正常腸道菌 群競爭。因此，現有通過綠色熒光蛋白基因的重組的大腸桿菌，無法良好地實 現實時跟蹤檢測動物腸道菌在逆境環境下(如不同藥物處理)的變化或變異情 況，也不利于掌握動物腸道菌在逆境下的變異規律。

發明內容

本發明實施例的目的在于克服現有技術的上述不足，提供一種可以與正常 定植的并與動物腸道其它菌群具有較強競爭性，并能適于逆境環境下便于實時 跟蹤檢測的熒光標記大腸桿菌。

為了實現上述發明目的，本發明實施例的技術方案如下：

一種可定植動物腸道的熒光標記大腸桿菌制備方法，包括如下步驟：

PCR擴增EGFP基因；

將所述PCR擴增獲得的EGFP基因與環狀質粒載體重組，得到重組質粒； 所述環狀質粒載體為pCR2.1c-TOPO或pTrcHisB；

獲取待定植動物腸道的大腸桿菌，并進行感受態處理后形成感受態腸道大 腸桿菌；

將重組質粒導入至感受態腸道大腸桿菌，形成轉化工程菌，即為本發明可 定植動物腸道的熒光標記大腸桿菌。

本發明進一步還提出一種根據上述方法制備的可定植動物腸道的熒光標記 大腸桿菌。

本發明的上述方法步驟綜合利用綠色熒光蛋白基因和原始腸道大腸桿菌的 優勢，構建出可穩定在動物腸道菌中表達的重組質粒pCR2.1c-TOPO-EGFP(弱 控制型)或pTrcHisB-EGFP(可調控的強控制型)，標記的動物腸道大腸桿菌 可用于示蹤研究，實時跟蹤檢測動物腸道菌在逆境環境下(如不同藥物處理) 的變化或變異情況，或用于研究微生物在食物和環境中的生長變化、以及可用 于許多其他相關研究。相比現有標記工程菌，取料于原始腸道大腸桿菌，并且 具有卡那霉素或氨芐青霉素等抗性，逆境環境下可以具有更優的競爭性，并且 其表達還可以通過跟蹤需求進行控制。

附圖說明

下面將結合附圖及實施例對本發明作進一步說明，附圖中：

圖1為本發明實施例可見光和紫外燈下觀察質粒pCR2.1c-TOPO-EGFP在 DH5α中的表達結果圖；

圖2為本發明實施例1和實施例2所獲得的可定植動物腸道大腸桿菌體外 培養實驗結果；

圖3為本發明實施例大鼠腸道大腸桿菌及具有EGFP標記的可定植大鼠腸 道的熒光標記大腸桿菌的體外生長曲線。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實 施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅 僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

本發明實施例提供一種可定植動物腸道的熒光標記大腸桿菌制備方法，包 括如下步驟：

S10，以pEGFP-C3基因為模板，利用特異性設計引物PCR擴增EGFP基 因；