[發明專利]一種基于軸向超高速掃描的三軸數字掃描光片顯微鏡

有效

• 申請號: 201410460425.0
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104407436B
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 陳良怡;宗偉健;孫育杰;陳宣楊
• 申請（專利權）人: 北京大學
• 主分類號: G02B26/10
• 分類號: G02B26/10;G02F1/03;G01N21/64
• 代理公司: 北京萬象新悅知識產權代理有限公司 11360
• 代理人: 賈曉玲

本發明提供一種基于軸向超高速掃描的三軸數字掃描光片顯微鏡，主要涉及熒光顯微鏡領域。通過在激發光路中設置光束光路快速變焦裝置，用于快速調制光的焦點位置；和快速光強調制裝置，用于快速調制光強；發明了一種在不改變光片厚度的條件下，可以增加并且調節掃描范圍的光片顯微鏡。這項新技術能夠提供亞微米級的z軸分辨率，在深層組織中(大于500μm)170×170μm²大小的視野以及高達1毫秒的時間分辨率。2P3A?DSLM解決了小型模式生物體的亞細胞結構以及活體動態過程的長時間成像問題。

技術領域

本發明涉及一種基于軸向超高速掃描的三軸數字掃描光片顯微鏡，主要涉及熒光顯微鏡技術領域。

背景技術

背景技術：

最近出現的光片熒光顯微鏡技術(light-sheet fluorescent microscopy，LSFM)已經給生物三維成像技術帶來了革命性變化。LSFM具有高時間分辨率以及很小的光損傷等特點，使得通過熒光成像對小型模式生物或組織的長時間觀察成為可能。

光片顯微鏡使用一層光束從樣品側面激發熒光樣品，通過照相設備檢測成像，其入射照明光路和照相設備接收熒光光路互相垂直。傳統光片顯微鏡分類：從激光光源講：分為連續光光片顯微鏡和雙光子光片顯微鏡。前者的好處是造價低，結構簡單。缺點是：穿透能力很弱，不適合深層組織成像。后者的好處是成像深度深，可以做活體組織成像。從系統構架來講：分為水平構架，垂直構架和倒置構架三種。水平構架中，光片照明的物鏡和信號接收的物鏡都是水平放置，即整個光路平面與水平面垂直，而樣本固定在一個瓊脂糖柱里豎直放置。這種構架的好處是，系統穩定，樣本可以360度自由移動。缺點是樣本制備相對繁瑣。垂直構架中，接收信號的物鏡垂直放置，與普通的正置顯微鏡相同。而激發光片的物鏡水平放置，使得產生的光片與水平面平行。優點是可以與現有的傳統正置顯微鏡兼容。缺點是激發光物鏡的光片厚度較厚，無法進行亞細胞結構觀察。倒置構架中，激發物鏡和發射物鏡成垂直的V字形倒置在樣本之上，形成的光片和成像面都與水平面成45度并互相垂直。該構架的好處是可以與傳統的樣本制備標準兼用。劣勢是結構不夠穩定，并且樣本不能隨意轉動。從光片形成方式來講，分為柱面鏡式和掃描式。柱面鏡式是通過一個柱面鏡讓一束激光在一個方向上聚焦，而另一個方向上保持準直而形成光片。這種方法的好處是結構簡單，劣勢是單位面積下的光功率較低，不適合做多光子掃描顯微鏡。掃描式是通過掃描器件，將一束準直的高斯光束在y軸方向上快速掃描，進而在照相機一次曝光時間內形成均勻的片狀光。優點是單位時間內的光功率強，可以做雙光子成像。缺點是結構相對復雜。

Truong等人通過將雙光子技術和光片顯微鏡結合起來實現了雙光子數字掃描光片顯微鏡(2P-DSLM)，該系統能夠在高散射的果蠅胚胎或者快速跳動的斑馬魚心臟中進行深層組織成像[1]。與經典的光片熒光顯微鏡結構相似，雙光子數字掃描光片顯微鏡使用一個低數值孔徑的物鏡(NA＜0.1)來實現長時間均勻照明，然而這導致產生的光片過厚，從而降低軸向分辨率和圖像的對比度。另一方面，Betzig和他的同事利用貝塞爾光束來產生一個纖薄的單光子光片，得到了相當不錯的軸向分辨率[2]。然而，這樣的系統中，視野和穿透深度是非常有限的。常規的LSFM顯微鏡或者雙光子數字掃描光片顯微鏡還有一個非常顯著的問題，就是在工作的時候，其光片的厚度主要是由掃描的數值孔徑NA決定，當增加掃描范圍的時候，必然會增加光片厚度。目前有關于光片顯微鏡的專利文獻比如CN102455501A，其利用機械移動的透鏡組進行光學變焦，變焦頻率十分低，導致不能實現快速拍照，限制了其實際產業方面應用范圍；并且其只能通過改變數值孔徑來改變照射區域的大小。在其增加掃描范圍的時候，也不能避免光片厚度的增加。

引用文獻：

1.Truong TV，Supatto W，Koos DS，Choi JM，Fraser SE.Nat Methods2011；8：757-760.

2.Gao L，Shao L，Higgins CD et al.Cell 2012；151：1370-1385.