[發明專利]基于人骨髓瘤細胞株及人B淋巴細胞融合制備的全人抗體

在審

• 申請號: 201410459164.0
• 申請日: 2014-09-10
• 公開（公告）號: CN104195110A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 張明順;王云生;楊永林;高峰
• 申請（專利權）人: 張明順
• 主分類號: C12N5/09
• 分類號: C12N5/09;C12N5/22;C07K16/18;C12R1/91
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 傅婷婷;徐冬濤

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，基于人骨髓瘤細胞株及人漿細胞融合制備全人抗體。

背景技術

治療性單克隆抗體具有廣泛的市場前景。目前的治療性單克隆抗體主要包括人鼠嵌合抗 體、人源化抗體以及全人抗體。人鼠嵌合抗體，應用人免疫球蛋白的Fc端結合到小鼠免疫球 蛋白的Fab端，保留了抗體識別抗原表位的能力，同時降低了鼠源性Fc端的免疫原性。在人 源化抗體中，應用鼠源性抗體Fab端的CDR替換人免疫球蛋白的CDR,進一步降低了治療性 抗體的免疫原性。不同于人鼠嵌合抗體或者人源化抗體，全人抗體中所有的氨基酸序列都來自 人，從而可以更好的降低治療性抗體的免疫原性。目前全人化抗體的制備主要依賴噬菌體肽庫 展示技術，其不足之處在于缺少體內的抗體親和力成熟過程，導致不易獲得高親和力抗體。同 時，噬菌體肽庫展示技術制備的全人抗體依賴于分子克隆和細胞轉染技術，抗體產量有限，制 備成本高。

發明內容

本發明的目的在于開發高效低成本的全人抗體制備技術。參考鼠源單克隆抗體制備，全人 單克隆抗體制備的關鍵在于：(一)人骨髓瘤細胞的篩查與誘導；(二)分泌抗體的漿細胞的抗 原特異性活化與富集。

2001年，英國劍橋大學A.卡帕斯博士參考小鼠骨髓瘤細胞的誘導方案，從人骨髓瘤細胞 中成功制備Karpas?707。Karpas?707可以與EBV病毒轉化的人B細胞融合形成雜交瘤細胞 株，分泌全人抗體。Karpas?707誘導方案于2009年在中國獲得專利授權保護。

不同于A.卡帕斯博士的方案，本發明(1)臨床分離人骨髓瘤細胞建立細胞系；(2)應用 誘變劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)處理人骨髓瘤細胞系；(3)應用8-氮鳥嘌呤和6- 巰基鳥嘌呤誘導細胞株獲得對次黃嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT)敏感性；(4)進一步誘導 細胞株對哇巴因耐受；(5)誘導細胞株對聚乙二醇耐受。本發明中的誘導方案能更有效的制備 符合要求的人骨髓瘤細胞。

抗原特異性漿細胞是產生特異性抗體的來源細胞。A.卡帕斯博士應用EBV病毒非特異性 轉化B淋巴細胞。本發明(1)培養成熟樹突狀細胞；(2)負載特異性抗原；(3)特異性活化 T淋巴細胞和B淋巴細胞；(4)B淋巴細胞分化為漿細胞；(5)富集漿細胞。本發明可以更高 效的獲得抗原特異性漿細胞，從而與人骨髓瘤細胞融合制備分泌單克隆抗體的雜交瘤細胞。

附圖說明

圖1MNNG誘導骨髓瘤細胞系突變

圖2骨髓瘤細胞系對HAT敏感：在培養第5天，>90％骨髓瘤細胞死亡。

圖3人骨髓瘤細胞WYZ-26的染色體型

圖4Ficoll分離外周血單個核細胞PBMC

圖5.流式細胞術檢測單核細胞純度

圖6.單核細胞分化為樹突狀細胞，細胞邊緣可見典型突起。

圖7.Western-blot檢測漿細胞分泌HBsAb

其中1.HBsAg疫苗接種者血漿，2.B淋巴細胞培養上清，3.漿細胞培養上清，4.骨髓瘤細胞 培養上清

圖8WYZ-26與人漿細胞融合可以制備骨髓瘤細胞，分泌全人抗體：雜交瘤瘤細胞無血清培養 基培養后，收集培養上清，純化IgG，經SDS-PAGE電泳后，可見重鏈和輕鏈兩條帶

具體實施方式

一.人骨髓瘤細胞分離、誘導和篩查

(一)臨床分離人骨髓瘤細胞建立細胞系；

多發性骨髓瘤，其腫瘤細胞起源于骨髓中的漿細胞，屬于B淋巴細胞瘤。其臨床特征是 骨髓漿細胞異常增生伴有單克隆免疫球蛋白或輕鏈(M蛋白)過度生成，極少數患者是不產生 M蛋白的未分泌型。臨床采集未分泌型多發性骨髓瘤患者外周血標本，應用完全培養基 (1640+10％FCS)培養，每周換液一次，經半年傳代，可見細胞集落形成，細胞增殖迅速， 有限稀釋法獲得單個細胞克隆，保存在-80℃。

(二)應用誘變劑N-甲基-N′-硝基-N-亞硝基胍(MNNG)處理人骨髓瘤細胞系；