[發(fā)明專(zhuān)利]一種利用黃單胞菌聯(lián)產(chǎn)α-熊果苷和黃原膠的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410458385.6
• 申請(qǐng)日: 2015-08-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104498565A
• 公開(kāi)（公告）日: 2015-07-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張鵬;趙磊;周建飛;劉春巧;陳毅明;張俊
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 北京化工大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12P19/44
• 分類(lèi)號(hào): C12P19/44;C12P19/06;C12N1/20;C12R1/64
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及利用野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243發(fā)酵液離心或微濾膜過(guò)濾后的菌體和上清酶液，分別采取游離細(xì)胞法催化合成α-熊果苷和無(wú)細(xì)胞發(fā)酵黃原膠的方法。

背景技術(shù)

熊果苷(Arbutin)是杜鵑花科熊果屬的熊果葉子細(xì)胞里的一種成分，具有良好的皮膚美白效果，化妝品行業(yè)中用途很廣。研究表明α-熊果苷的化學(xué)性質(zhì)比β型更加穩(wěn)定，美白效果更好，且對(duì)人體細(xì)胞的副作用更小。現(xiàn)在α-熊果苷的合成方法也多是通過(guò)微生物發(fā)酵添加底物來(lái)進(jìn)行。

黃原膠(Xanthan?gum)是一種高分子胞外多糖，大多是由野油菜黃單胞菌(Xanthomnas?campestris)發(fā)酵產(chǎn)生。黃原膠具有特殊的三級(jí)螺旋分子結(jié)構(gòu)，使其具有良好的水溶性、假塑性，常被用來(lái)做乳化劑、增稠劑等，已廣泛用于食品、石油、地質(zhì)、醫(yī)藥、農(nóng)藥、輕工業(yè)、印染、陶瓷等工業(yè)領(lǐng)域，有著很大的市場(chǎng)潛力。

前人對(duì)于黃單胞菌催化生產(chǎn)α-熊果苷和生產(chǎn)黃原膠兩個(gè)方向分別有一定的研究。許喜林等利用離心方法得到除細(xì)胞發(fā)酵液，加入培養(yǎng)基后得到的黃原膠產(chǎn)量較一般方法略高，證明這種方法的可行性。王秀捧等探究了游離細(xì)胞法產(chǎn)α-熊果苷的條件，其轉(zhuǎn)化率約為80%，但是對(duì)苯二酚耐受度較低，只有30mmol/L。游離細(xì)胞法和無(wú)細(xì)胞發(fā)酵都有著各自的優(yōu)點(diǎn)：游離細(xì)胞有著酶活性高的特點(diǎn)，反應(yīng)條件容易控制，也利于熊果苷分離純化，但由于缺少黃原膠的保護(hù)，對(duì)對(duì)苯二酚的耐受度偏低。無(wú)細(xì)胞發(fā)酵的好處是對(duì)于氧氣的需求量較小，在分離純化中也更容易得到產(chǎn)品，降低物料消耗。但由于排出胞外的酶量小，酶促反應(yīng)要求高，使得到的黃原膠在產(chǎn)量和粘度這兩個(gè)重要指標(biāo)上都低于細(xì)胞發(fā)酵的水平。但利用同一菌種聯(lián)產(chǎn)兩種產(chǎn)物的研究至今未見(jiàn)報(bào)道。

本發(fā)明采用同一菌種，利用創(chuàng)新的聯(lián)產(chǎn)方式，在兩種產(chǎn)品的生產(chǎn)中分別采用游離細(xì)胞和無(wú)細(xì)胞發(fā)酵的方法，以期達(dá)到最大的產(chǎn)出比和最小的能源消耗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是提供一種利用黃單胞菌聯(lián)產(chǎn)α-熊果苷和黃原膠這兩種產(chǎn)物的方法，分別采用游離細(xì)胞催化合成α-熊果苷、無(wú)細(xì)胞發(fā)酵黃原膠，具有酶活性高、反應(yīng)條件容易控制、產(chǎn)物易于分離純化的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明利用同一菌種，經(jīng)過(guò)高速離心或微濾膜過(guò)濾處理后分別用于聯(lián)產(chǎn)兩種產(chǎn)物，可以達(dá)到節(jié)約物料、降低成本的目的，帶來(lái)較好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，具有創(chuàng)新性，為工業(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

本發(fā)明的整體技術(shù)構(gòu)思是：

利用野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243聯(lián)產(chǎn)α-熊果苷和黃原膠的方法，該方法由下列工藝步驟組成：

(1)??????野油菜黃單胞菌（Xanthomonas?campestris）CGMCC?NO.1243斜面種子的制備和一級(jí)液體發(fā)酵；

(2)??????將步驟（1）發(fā)酵液高速離心或微濾膜過(guò)濾獲得菌體和上清酶液；

(3)??????游離細(xì)胞法合成α-熊果苷；

(4)??????無(wú)細(xì)胞發(fā)酵生產(chǎn)黃原膠。

本發(fā)明的具體工藝步驟及工藝條件是：

步驟（1）中培養(yǎng)基成分為：

蔗糖15~30g/L、牛肉蛋白胨1~10g/L、MgS0₄·7H₂0?1~10g/L、酵母粉?1~10g/L、K₂HP0₄·3H₂0?1~10g/L、NaCl??1~10g/L、瓊脂5~20g/L。（斜面培養(yǎng)基加，液體培養(yǎng)基不加）

斜面菌種的制備工藝為：將黃單胞菌接入裝有固體培養(yǎng)基的試管中，制成斜面菌種，在20~35℃條件下培養(yǎng)12~48小時(shí)。

一級(jí)液體發(fā)酵的制備工藝為：將斜面生長(zhǎng)的黃單胞菌用滅菌后的生理鹽水溶解后，接種到50ml液體培養(yǎng)基中，接種量為1%~10%，在20~35℃、100~200r/min的搖床中培養(yǎng)，采用好氧培養(yǎng)的方式培養(yǎng)12~48小時(shí)。

步驟（2）中高速離心：

將步驟（1）發(fā)酵液在5000~20000r/min條件下高速離心10~30min，或者采用0.20μm~0.45μm微濾膜過(guò)濾收集菌體和上清酶液。

步驟（3）中游離細(xì)胞法合成α-熊果苷具體工藝為：