[發明專利]一種高通量篩選羰基還原酶活性和對映選擇性的方法

在審

• 申請號: 201410457947.5
• 申請日: 2014-09-11
• 公開（公告）號: CN105463060A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 吳洽慶;馮進輝;陳曦;馬延和;朱敦明
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/32
• 分類號: C12Q1/32;C12Q1/26
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種以NAD（P）H為輔酶的羰基還原酶活性和立體選擇性的高通量篩選方法。

背景技術

羰基還原酶是一類非常重要的生物催化劑，能夠實現羰基底物的不對稱還原反應。目前，羰基還原酶的研究與應用已經有了飛速的發展，來源于酵母和馬肝的羰基還原酶均有商品供應，可以像有機催化試劑一樣購買。羰基還原酶在還原脂肪酮底物，特別是當羰基兩邊的取代基團相差不大時，表現出了化學催化劑不具有的高立體選擇性。羰基還原酶已經開始在工業上應用，應用的形式有全細胞和分離酶兩種方式，適用底物范圍由取代基較小的直鏈脂肪酮擴展到了較大位阻的支鏈脂肪酮、芳香酮、雙芳香取代酮、環烷酮、炔基酮等，由單羰基化合物到1,2-，1,3-，1,4-等雙羰基化合物，由單純的酮化合物擴展到α,β-鹵代，羧酸酮酯等功能化羰基化合物（Karkheinz,D.;Garald,G.;Oliver,M.《EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis》,ThirdEdition.Wiley-VCH:Weinheim,2012,1206）。

由于羰基還原酶本身的特點，當其催化非天然底物時，往往不能獲得好的轉化率及立體選擇性，酶的特性急需改造提高。隨著科學家的深入研究，定向進化技術可以顯著提高酶活性、增加酶的穩定性、改變酶的底物特異性等，已經成為一種快速高效改進酶催化特性的手段。雖然根據已知酶的分子結構數據和對催化機理的認識選擇酶分子特定區域進行隨機飽和突變及其他突變手段的改進，使得在不影響突變效果的前提下降低突變庫的規模，可顯著提高分子改造的效率，但是定向進化技術中，獲得優質酶品的篩選方法依然是一個急需解決的問題（Reetz,M.T.Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,138）。目前羰基還原酶的活性篩選依賴于酶標儀測定，基本可以實現高通量篩選，而其立體選擇性檢測依然是依靠液相色譜(HPLC)和氣相色譜(GC)兩種常用的方法，這兩種方法目前在對羰基還原酶的立體選擇性實現高通量篩選方面依然存在難度（VozkaJ.,KalkováK.,JaneikováL.,etal.Anal.Lett.2012,45,2344；CavazziniA.,PastiL.,MassiA.,etal.Anal.Chim.Acta.2011,706,205;JibutiG,MskhiladzeA.,TakaishviliN.,etal.J.Sep.Sci.2012,35,2529）。

偶氮染料一般具有明亮的顏色，偶氮還原酶是細菌降解偶氮染料的關鍵酶。一種偶氮還原酶可作用于一種或幾種偶氮染料，它通過還原特定的偶氮染料的偶氮鍵而使染料的顏色褪去。azoB是從PigmentiphagakullaeK24中克隆并鑒定的一種偶氮還原酶基因，編碼一種由203個氨基酸組成的非核黃素依賴型的偶氮還原酶AzoB。該酶可以利用NAD(P)H作為電子供體，還原偶氮染料金橙Ⅰ的偶氮鍵使其顏色消失。

CN102517378A描述了一種檢測還原型輔酶NAD（P）H的熒光發射實現羰基還原酶篩選，但是該方法需要額外的熒光光譜儀，與酶標儀的檢測通量持平。

因此發明一種直觀可視的羰基還原酶的活性和立體選擇性篩選的高通量篩選方法是非常必要的。

發明內容

本發明提供了一種羰基還原酶活性和立體選擇性的高通量篩選方法。

根據羰基還原酶催化可逆的氧化還原反應的原理，利用羰基還原酶可以在NAD(P)⁺存在的條件下催化相應的醇類底物生成對應的酮類物質以及NAD(P)H，而偶氮還原酶則利用羰基還原酶生成的NAD(P)H，作用于偶氮染料引起偶氮染料的顏色變化，利用目測的方式可以直接實現羰基還原酶活性和立體選擇性的高通量篩選，如圖1所示。

該篩選方法通過優化確定為：反應在96孔板中進行，反應體系200μL，100mM緩沖液(pH6.0~9.0)、0.1mM~50mM底物、0.1mM~1mMNADP+以及0.001mg~10mg純化的羰基還原酶，2min后，加入0.001mg~10mg的偶氮還原酶AzoB，以及偶氮染料金橙Ⅰ(終濃度0.01~0.5mM)，反應2min及更長的時間。