[發(fā)明專利]豬Six1蛋白的體外表達及其多克隆抗體的制備方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410457862.7
• 申請日: 2014-09-10
• 公開（公告）號: CN104263746A
• 公開（公告）日: 2015-01-07
• 發(fā)明（設計）人: 黃志清;陳小玲;徐孟;陳代文;余冰
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/47;C07K16/18
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

1.一種豬Six1蛋白的體外表達方法，其特征是：包括下列步驟：

(1)提取豬背最長肌總RNA；

(2)構建用于表達豬Six1蛋白的大腸桿菌重組表達載體；

(3)將重組表達載體導入大腸桿菌表達菌株BL21(DE3)中，構建攜帶重組表達載體的基因工程菌；

(4)培養(yǎng)基因工程菌至OD₆₀₀達到0.4～0.6，加入誘導劑IPTG，誘導豬Six1基因在該基因工程菌中表達；

(5)純化表達系統(tǒng)表達的重組豬Six1；

(6)重組豬Six1蛋白表達形式的鑒定。

2.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中，構建載體時，克隆豬Six1基因的插入位點為Nde?I和Xho?I酶切位點。

3.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(2)中，構建載體時，所用的引物序列如下所示：

上游：5’-CCCAATTCCATATGTCGATGCTGCCATCGTTCGGCTTC-3’

下游：5’-AAACTCGAGGGACCCTAAGTCCACCAGACTGGAG-3’；

PCR反應條件為：95℃預變性3min，然后95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共進行35個循環(huán)，最后72℃延伸10min。

4.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(4)中，誘導劑IPTG濃度為2mmol/L，誘導時間為2小時。

5.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(5)中，所述純化是用鎳柱親和層析法中的變性條件方法進行純化。

6.如權利要求1所述方法，其特征在于，步驟(6)中，所述重組豬Six1蛋白表達形式的鑒定為超生破碎法，其中超聲破碎功率為260W，超聲破碎2秒，間隔5秒，作用30分鐘，并經SDS-PAGE電泳分析。

7.如權利要求1～6任一項所述方法所得的豬Six1蛋白，其特征在于，所述重組豬Six1蛋白C端帶有6個組氨酸標簽。

8.一種豬Six1多克隆抗體的制備方法，其特征是：挑取構建含有攜帶重組表達載體的基因工程菌，接種到4ml含有濃度為50μg/ml的卡那霉素的液體LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)過夜活化，將活化的基因工程菌按1％接種于50ml含有濃度為50μg/ml的卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37℃、250rpm振蕩培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.4-0.6時加入IPTG，使其終濃度為2.0mmol/L，30℃誘導2小時，菌液離心，收集菌體，經裂解、純化后收集蛋白，將純化后重組豬Six1蛋白作為抗原免疫Sprague-Dawley大鼠，免疫前斷尾采血2ml，收集血清作為陰性血清，300μg重組豬Six1蛋白與等體積的弗氏完全佐劑乳化后免疫大鼠，2周后用200μg重組豬Six1蛋白與等體積的弗氏不完全佐劑乳化后免疫大鼠，每隔10天再次加強免疫，共4次免疫，最后一次免疫7天后采血，收集抗血清。