[發(fā)明專利]一種高活性復合纖維素酶及其制備和應(yīng)用方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410456979.3
• 申請日: 2014-09-10
• 公開（公告）號: CN104293746B
• 公開（公告）日: 2017-07-14
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳介南;詹鵬;王芳;張林;王揮;劉進;陳立君
• 申請（專利權(quán)）人: 中南林業(yè)科技大學;長沙聯(lián)美生物科技有限責任公司
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12P19/14;C12R1/685;C12R1/885
• 代理公司: 長沙市融智專利事務(wù)所43114
• 代理人: 袁靖

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于酶工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用生物技術(shù)手段制備高活性復合纖維素酶，并涉及該復合纖維素酶在酶解糖化木質(zhì)纖維素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素是自然界中蘊藏量最豐富、最廉價的可再生資源，占地球總生物量的40％左右。通過生物轉(zhuǎn)化技術(shù)將天然纖維素降解為可以利用的糖，對于緩解地球能源危機和環(huán)境污染具有重大意義。纖維素酶是指能降解纖維素的一類多組分復合酶系的總稱，主要包括三個酶組分：內(nèi)切型-β-葡聚糖酶(exdo-1，4-β-D-glucanase，EG)、外切型-β-葡聚糖酶(exo-1，4-β-D-glucanase，CHB)和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase，BG)。纖維素酶的作用機理是EG先降解纖維素分子內(nèi)部的非結(jié)晶區(qū)形成新的游離末端；然后由CHB作用于纖維素線狀分子非還原性末端水解β-1，4-糖苷鍵形成纖維二糖；最后由BG水解纖維二糖為2個葡萄糖。

在纖維素的酶解糖化過程中，若BG型酶不能有效的酶解纖維二糖，將會對EG酶和CHB酶產(chǎn)生很強的反饋抑制作用，最終限制纖維素的酶解糖化率。為提高纖維素酶的酶解糖化率，十分有必要通過人工措施制備具有高活性EG、CHB和BG型纖維素酶的復合纖維素酶。目前公認的能產(chǎn)生高活性EG和CHB型纖維素酶的菌種為里氏木霉，而該菌種所產(chǎn)的BG型纖維素酶活性較低。目前能產(chǎn)生高活性BG型纖維素酶的菌種為黑曲霉。將黑曲霉生產(chǎn)的β-葡聚糖苷酶與里氏木霉生產(chǎn)的纖維素酶復合制備出高活性復合纖維素酶，優(yōu)化酶系配比，提高木質(zhì)纖維素的酶解得率，具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種高活性復合纖維素酶及其制備方法和其在酶解糖化木質(zhì)纖維素中的應(yīng)用，本發(fā)明能夠顯著提高酶解糖化木質(zhì)纖維素的效率，尤其能夠提高對于蒸汽爆破楊木的酶解效率。

一種高活性復合纖維素酶的制備方法，分別將保藏編號為CCTCC NO：M 2012129的黑 曲霉C112生產(chǎn)的β-葡萄糖苷酶與保藏編號為ATCC 56765的里氏木霉RUT C30生產(chǎn)的纖維素酶濃縮提純，并將濃縮后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為1.048～2.685；黑曲霉C112通過產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培養(yǎng)基配方為：玉米芯25～30g/L，稻草粉20～30g/L，蛋白胨5～6g/L，(NH₄)₂SO₄10～13g/L，KH₂PO₄6～8g/L，CaCl₂·2H₂O 0.5～1.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5～1.0g/L，吐溫-801～2ml/L，Mandels微量元素濃縮液0.5～1ml/L，1mol/L檸檬酸緩沖液100～150ml/L，加水配制成1L。

上述方法優(yōu)選將濃縮后的酶液混合使得β-葡萄糖苷酶活/濾紙酶活比值為1.536；黑曲霉C112通過產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基得到高活力的β-葡萄糖苷酶，培養(yǎng)基配方為：玉米芯25g/L，稻草粉30g/L，蛋白胨5g/L，(NH₄)₂SO₄10g/L，KH₂PO₄6g/L，CaCl₂·2H₂O 0.9g/L，MgSO₄·7H₂O 0.9g/L，吐溫-801ml/L，Mandels微量元素濃縮液1ml/L，1mol/L檸檬酸緩沖液100ml/L，加水配制成1L。

上述方法中黑曲霉C112的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)過程如下：將黑曲霉菌C112的種子培養(yǎng)液，以體積百分比5-8％的接種量接種于裝有40-60ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，26-28℃，180-220r/min條件下培養(yǎng)4-6天，離心，取上清液得到粗酶液。

黑曲霉C112的種子培養(yǎng)：從保存的黑曲霉C112土豆固體平板培養(yǎng)基中挑取孢子，接種于裝有40-60ml種子培養(yǎng)基的250ml搖瓶中，26-28℃，180-220r/min條件下培養(yǎng)2～3天作為接種物；黑曲霉C112種子培養(yǎng)基：馬鈴薯250～300g/L，葡萄糖15～25g/L，pH值6.5～7.0。