[發(fā)明專利]一種應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選微生物培養(yǎng)液樣品試劑盒及其制備

在審

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• 申請日: 2014-09-09
• 公開（公告）號: CN104237367A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 成曉亮;鄭可嘉
• 申請（專利權(quán)）人: 武漢品生科技有限公司
• 主分類號: G01N27/64
• 分類號: G01N27/64
• 代理公司: 南京知識律師事務(wù)所 32207
• 代理人: 胡玲

技術(shù)領(lǐng)域

本技術(shù)屬于分析化學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域，具體涉及表面激光解析質(zhì)譜領(lǐng)域。

背景技術(shù)

表面激光解析質(zhì)譜是近年來發(fā)展起來的一種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其中以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)為最重要的實例，此項發(fā)明獲得過諾貝爾化學(xué)獎。主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源(MALDI)和飛行時間質(zhì)量分析器(TOF)。MALDI的原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，在電離過程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，而使生物分子電離的過程。因此它是一種軟電離技術(shù)，適用于混合物及生物大分子的測定。TOF的原理是離子在電場作用下加速飛過飛行管道，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測即測定離子的質(zhì)荷比(M/Z)與離子的飛行時間成正比，檢測離子。MALDI-TOF-MS具有靈敏度高、準確度高及分辨率高等特點，為生命科學(xué)等領(lǐng)域提供了一種強有力的分析測試手段。

然而，以基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜為首的所有基于表面激光解析的質(zhì)譜都需要將樣品制備在特制靶板上面，其操作是將樣品分散在基質(zhì)分子中并形成晶體。當用激光照射晶體時，基質(zhì)從激光中吸收能量，樣品解吸附，基質(zhì)-樣品之間發(fā)生電荷轉(zhuǎn)移使得樣品分子電離，電離的樣品在電場作用下飛過真空的飛行管，根據(jù)到達檢測器的飛行時間不同而被檢測，即通過離子的質(zhì)量電荷之比(M/Z)與離子的飛行時間成正比來分析離子，并測得樣品分子的分子量。焦點問題就在于通用的基質(zhì)分子的分子量在1000-3000da,造成了過量的背景質(zhì)譜峰。這就決定了所有此類基于表面激光解析的質(zhì)譜分析只能適用于大分子檢測，比如蛋白質(zhì)，長鏈多肽，核酸，高分子材料等等，而不能應(yīng)用于小分子檢測(分子量小于1000da)，或者說基于表面激光解析的質(zhì)譜分析的高靈敏度/高通量等獨特的優(yōu)勢無法施展在小分子分析檢測上面.而分子量小于1000da的小分子卻是對人類最重要的最具應(yīng)用價值的一類化學(xué)產(chǎn)品，例如95％以上的藥物小分子，所有的氨基酸，維生素等等和人類生活健康相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)。

目前現(xiàn)有技術(shù)針對小分子檢測和篩選還停留在光譜法檢測，例如熒光發(fā)光檢測或者衍生出可以熒光檢測的底物，但此類檢測要求目標小分子分子結(jié)構(gòu)具有光活性集團，另一弊端就是往往光度法靈敏度較低，檢測不到微量的小分子濃度。液相質(zhì)譜(LC-MS)及氣相質(zhì)譜(GC-MS)的已經(jīng)開始應(yīng)用在小分子的檢測和高通量篩選。但需要消耗大量的人力和溶劑耗材，而且一個樣品從制備到質(zhì)譜分析再到出結(jié)果需要相當長一個過程，根據(jù)要求不同，分析一個樣品從樣品制備到拿到結(jié)果需要30-60分鐘，遠遠不能滿足現(xiàn)代生物醫(yī)藥發(fā)展的高通量篩選要求。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明目的：找到一種制備方法簡單、成本較低的樣品制備方法，節(jié)省開支與時間。

技術(shù)方案：一種應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選微生物培養(yǎng)液樣品試劑盒，由同等體積的樣品與基本裂解液組成，基本裂解液為QL2，QL2物質(zhì)組成及體積比為：10-50％甲醇、50-90％乙氰、1-7％甲酸。

一種應(yīng)用于小分子定性定量分析檢測和高通量篩選微生物培養(yǎng)液樣品試劑盒的制備，將微生物培養(yǎng)液樣本放置室溫，充分解凍；加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液，在50度水浴中反應(yīng)5分鐘；離心；收集上清液；基本裂解液為QL2，QL2，QL2物質(zhì)組成及體積比為：10-50％甲醇、50-90％乙氰、1-7％甲酸。

優(yōu)選方案為QL2物質(zhì)組成及體積比為：50％甲醇、50％乙氰、1％甲酸。

有益效果：1、制備方法簡單；2、成本較低。

附圖說明

圖1利用本發(fā)明檢測到的高產(chǎn)脂肪酸酵母菌的裂解后的質(zhì)譜圖.

具體實施方式

微生物培養(yǎng)液樣品制備試劑盒基本裂解液QL2及樣品制備方法

將微生物培養(yǎng)液樣本(單個離心管，96孔多孔板，384孔多孔板)放置室溫10分鐘，充分解凍。加入-20度同等體積的混合溶液-基本裂解液QL2(QL2物質(zhì)組成及體積比為：10-50％甲醇、50-90％乙氰、1-7％甲酸)，作用5分鐘，并在50度水浴中作用5分鐘。3000rmp離心10分鐘后，收集上清液。

如圖1所示為酵母菌發(fā)酵后，裂解細菌的產(chǎn)物分析。我們可以從此方法來快速篩選高產(chǎn)菌種。