[發(fā)明專利]一種快速檢測生物表面活性劑產(chǎn)量的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410455738.7
• 申請日: 2014-09-09
• 公開（公告）號: CN104155253A
• 公開（公告）日: 2014-11-19
• 發(fā)明（設計）人: 王增林;馮云;林軍章;王靜;宋欣;段傳慧;巴燕;劉濤;徐登霆;徐鵬;王剛;曹嫣鑌
• 申請（專利權(quán)）人: 中國石油化工股份有限公司;中國石油化工股份有限公司勝利油田分公司采油工藝研究院
• 主分類號: G01N21/31
• 分類號: G01N21/31;G01N21/78
• 代理公司: 北京世譽鑫誠專利代理事務所(普通合伙) 11368
• 代理人: 郭官厚

技術(shù)領域

本發(fā)明涉及一種生物表面活性劑的檢測方法，屬于生物技術(shù)領域，具體涉及到一種快速檢測生物表面活性劑產(chǎn)量的方法。

背景技術(shù)

生物表面活性劑(Biosurfactants，簡稱BS)是指微生物(多數(shù)是細菌、酵母菌、真菌)在一定條件下培養(yǎng)時，代謝合成的一種次級代謝產(chǎn)物，是集極性親水基和非極性疏水基結(jié)構(gòu)于一身的兩親化合物，能夠顯著降低表面張力和界面張力，促進原油的乳化和分散。與化學表面活性劑相比，其具有特異性強、高效、低毒、不污染環(huán)境等優(yōu)點。

目前已有的生物表面活性劑檢測方法有兩種：一種是高效液相色譜法，該方法能夠較為準確分析發(fā)酵樣品中的生物表面活性劑含量，但需要高純度的標品，一般實驗室條件下不容易獲得，且測試成本高、周期長；另一種是利用界面張力與表面活性劑濃度之間的關(guān)系來定量表面活性劑的方法，這種方法通常是經(jīng)驗性的，不能排除發(fā)酵液中其他具有表面活性的非目標產(chǎn)物對分析結(jié)果的影響，因此，該方法測試結(jié)果的準確性不高。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種快速檢測生物表面活性劑產(chǎn)量的方法，該方法具有操作簡單、耗時短、效率高和成本低的特點。

一種快速檢測生物表面活性劑產(chǎn)量的方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)培養(yǎng)微生物

將產(chǎn)生物表面活性劑的菌種在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，接種量為2％～5％(V/V)，培養(yǎng)溫度30℃～37℃，轉(zhuǎn)速180～200rpm，培養(yǎng)時間24～48h，得到微生物發(fā)酵液。

(2)制備上清液

將1.5mL上述發(fā)酵液5000rpm離心5min，14000rpm離心5min，取300uL上清液加入2mL離心管，然后加1.2mL甲醇，5000rpm離心5min，14000rpm離心5min，用1mL針管取上清液過0.45um有機濾膜，得到上清液。

(3)測定吸光光度值

取75uL菌液上清和150uL聚聯(lián)乙炔囊泡溶液于2mL離心管中，25-30℃水浴中反應10min，然后加到96孔板中，用酶標儀分別檢測640nm和550nm的吸光值，即A₆₄₀和A₅₅₀。

(4)計算比色響應值

計算比色響應值CR％，計算公式為：

CR％＝[(PB₀-PB_f)/PB₀]×100％

其中：PB＝A₆₄₀/(A₆₄₀+A₅₅₀)；

PB₀是囊泡顏色改變前的值；

PB_f是外界刺激體系顏色發(fā)生改變后的值。

(5)確定生物表面活性劑的產(chǎn)量

取生物表面活性劑標品配制成濃度為1g/L的母液，分別稀釋到50、100、150、200、250、300、400、500mg/L，分別取75uL各濃度溶液于2mL離心管中，再加入150uL聚聯(lián)乙炔囊泡溶液，25-30℃水浴中反應10min，然后加到96孔板中，用酶標儀分別檢測640nm和550nm的吸光值，計算比色響應值CR％，以CR％值為縱坐標，表面活性劑濃度為橫坐標，通過線性回歸處理得到標準曲線，發(fā)酵樣品取三份平行樣分別測定吸光值，按照公式計算比色響應值CR％，最終求得比色響應值的平均值，代入標準曲線方程即可得到發(fā)酵液中生物表面活性劑的產(chǎn)量。

所述的發(fā)酵培養(yǎng)基組成為葡萄糖3g/L、蛋白胨3g/L、酵母粉3g/L、磷酸氫二鉀2.7g/L、氯化鈉5g/L。

所述的聚聯(lián)乙炔囊泡的合成方法是：稱取0.1g?10,12-二十五碳二炔酸溶于1mL氯仿中；振蕩待其完全溶解后用0.45um有機濾膜過濾，得到的溶液放入50mL磨口三角瓶中，40℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，避光放置；再用50mL、pH7.4的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液溶解，90℃水浴中預熱10min，70℃下超聲15min，轉(zhuǎn)至用錫紙包裹的50mL離心管中，在4℃冰箱中靜置12h，然后在波長254nm的紫外燈下聚合3min，得到聚聯(lián)乙炔囊泡溶液。

所述的4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液，其配制方法為稱取2.383g?4-羥乙基哌嗪乙磺酸溶解在400mL蒸餾水中，加入0.5～1.0mol/L氫氧化鈉調(diào)pH7.4，定容至500mL，4℃保存即獲得4-羥乙基哌嗪乙磺酸緩沖液。

本發(fā)明優(yōu)點及有益效果如下：