[發明專利]一種提取和初步純化河豚毒素的方法

有效

• 申請號: 201410453916.2
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104311569A
• 公開（公告）日: 2015-01-28
• 發明（設計）人: 楊育暉
• 申請（專利權）人: 無錫科奧美萃生物科技有限公司
• 主分類號: C07D491/22
• 分類號: C07D491/22
• 代理公司: 北京品源專利代理有限公司 11332
• 代理人: 鞏克棟;楊晞

技術領域

本發明涉及色譜柱技術領域，具體涉及一種提取和初步純化河豚毒素的方法，尤其涉及一種使用弱陽離子交換色譜柱進行的提取和初步純化河豚毒素的方法

背景技術

河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是鲀魚類(俗稱河豚魚)及其它生物體內含有的一種生物堿。其分子式為C₁₁H₁₇O₈N₃，分子量為319，其為氨基全氫喹唑啉型化合物，是自然界中所發現的毒性最大的神經毒素之一，可高選擇性和高親和性地阻斷神經興奮膜上的鈉離子通道。河豚毒素是小分子量、非蛋白質的神經性毒素，其毒性比劇毒氰化鈉還要高1250多倍，0.5mg即可致死。河豚毒素與鈉通道的SS1/SS2亞基具有高特異性和高親和力的結合，過去幾十年已作為一種工具藥物廣泛用于藥理學研究，特別是在神經和肌肉生理領域。TTX具有鎮痛、降壓、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效。將河豚毒素應用于制藥領域的先決條件是制備足量高純度、高質量的河豚毒素。

對河豚毒素的提取一般分為兩步，包括從河豚魚組織中提取河豚毒素粗品，即提取步驟，和從河豚毒素粗品中精制高純度河豚毒素，即純化精制步驟。

1950年，Yokoo成功獲得了最小致死劑量(MLD)為0.01gamma的結晶河豚毒素。(J.Chem.Soc.Japan71，590(1950))。他從河豚魚獲得卵巢組織，用水浸出河豚毒素，蒸干，獲得MLD為40.gamma的干物質。接著他用醋酸鉛和氨沉淀毒素，然后用磷酸鎢酸和汞苦味酸鹽除去雜質，用苯肼除糖。再次使用汞苦味酸鹽以沉淀毒素，接著用苦酮酸-甲醇-苦酮酸處理獲得結晶毒。但該提取方法用20公斤卵巢，只獲得13毫克的結晶河豚毒素。

在1951年，Nagai(Fukuoka?Ishi45，1(1954))使用離子交換樹脂(Amberlite?IRC-50)吸附毒素，用鹽酸溶液洗脫，然后用Amberlite?IR-4B處理該洗脫液以除去鹽酸。濃縮后，用無水乙醇來提取毒素。該提取方法用20公斤河豚魚的卵巢只得到2.5毫克毒素晶體。

1952年，Tsuda和Kawamura使用圓形濾紙色譜法(K.Tsuda等人，J.Pharm.Soc.Japan72,187,771(1952))獲得MLD＝10μg/公斤毒素。后來他們通過活性炭柱層析發展了大規模生產的方法(Tsuda,Kagaku?no?Ryouiki,supplement,80,9(1967))，能夠處理千公斤豚魚卵巢，并取得10克MLD＝10.μg/公斤毒素。同時，Woodward(R.B.Boodward,Pure?Appl.Chem.9,49-74(1964)取得了類似的結果。

1964年，Goto?Toshio等人(Goto?Toshio?and?Takahashi等人,J.Chem.Soc.Japan85,508(1964))簡化了工藝流程，采用離子交換和活性炭吸附，從百公斤河豚卵巢只得到1-2克所謂的粗毒素。

1980年后，一些改進的方法不時被報道，但普遍跟進Goto?Toshio等人的方法，產量沒有增加。值得指出的是，廣西和加拿大Wex?Medical?Instrumentation?Co.,Ltd.發表的2003年美國專利US6,552,191中提供的提取方法是迄今為止最好的，產量比其他方法增加了3倍，處理20公斤河豚卵巢，取得1克80-90％純度的河豚毒素。

然而，所有這些方法都包含一些讓河豚毒素大量損失的步驟，例如：(1)醋酸提取液加熱脫脂；(2)使用離子交換樹脂和活性炭吸附；(3)調節pH到堿性條件，沉淀河豚毒素重結晶等等。此外，從河豚卵巢等組織樣品提取河豚毒素是一個緩慢的過程，是整個工藝中的限速步驟，需要重復8-20次醋酸提取，同時伴有河豚毒素的大量損失和失活。

專利CN1470514A、CN101391999A、CN102584843A、CN101367821A以及CN102584843A都公開了使用高效液相進行河豚毒素的提取和純化，但本領域的研究依然進展緩慢。河豚毒素不溶于絕大多數有機溶劑，在強酸性和強堿性條件下的水相中非常不穩定，即使是在弱酸性條件下LC-MS或LC-MS/MS分析表明，河豚毒素8小時后也失去5-30％活性。這些特點讓河豚毒素純化精制充滿技術挑戰。

綜上所述，本領域急需尋找一種方法以應用于從河豚魚組織中提取和初步純化河豚毒素粗品。

發明內容