[發明專利]一種嗜熱厭氧桿菌及利用其生產乙醇的方法

有效

• 申請號: 201410453513.8
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104263680B
• 公開（公告）日: 2017-02-01
• 發明（設計）人: 李爽;賴志城;王菊芳
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12P7/06;C12R1/01
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司44245
• 代理人: 宮愛鵬

技術領域

一種生產乙醇的菌株和其高濃度糖耐受提高的馴化方法，以及利用該菌株生產乙醇的方法。本發明涉及以葡萄糖、木糖為主要原料，利用嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium?aotearoense?SCUT27/Δldh)突變株發酵生產乙醇的方法。

背景技術

乙醇是一種新型清潔燃料，是可再生能源開發利用的重要方向。發展生物乙醇是大勢所趨。第二代生物乙醇利用植物纖維經過預處理、無機酸或纖維素酶水解再通過生物發酵方式生產。而氫能因其清潔、能量密度高、制取方法多樣等特點，吸引著研究者們的關注。

以纖維質類物質為原料發酵生產乙醇的主要障礙在于成本過高。采用嗜熱厭氧菌(Thermoanaerobacterium)發酵能夠較好的解決該困難。以其為發酵菌株生產化學品具有如下幾方面的優勢(O-Thong,S.et?al.,International?Journal?of?Hydrogen?Energy,2008.33(4)：1204-1214)：(1)降低以纖維質類原料發酵過程中的纖維素酶添加量。這是因為該類菌株本身即是一類半纖維素分解微生物，其能夠在高溫下水解木聚糖發酵產生多種化學品，從而減少了纖維素酶的需求量。(2)高溫連續發酵生產過程，有利于乙醇的分離純化。(3)可以生料發酵生產乙醇。由于工業規模發酵生產乙醇過程中，純種發酵對于設備的無菌要求較高，因此大幅增加了經濟成本。但采用嗜熱菌發酵生產，由于絕大部分常溫微生物較難在高溫下生產，因此對發酵過程的無菌要求不高，從而進一步降低了生產成本。(4)能夠利用高溫有機廢水為發酵原料，這一方面降低了生產成本，另一方面也減輕了環境壓力。

申請人前期研究中篩選到一株嗜熱厭氧桿菌(Li,S.,et?al.,Bioresource?Technology,2010,101(22)：8718-8724，Cai,Y.,et?al.,Enzyme?and?Microbial?Technology,2011.48(2):p.155-161)，該菌株能夠有效利用葡萄糖、木糖等底物發酵積累乙醇、氫氣等。通過對其進行基因改造，敲除乳酸脫氫酶基因，代謝途徑改造后，突變體H₂和乙醇產量分別提高了2.7和2.4倍。但該菌株在高濃度糖底物情況下，受到高糖滲透應激的影響，導致生長遲滯期過長，導致發酵周期過久，生產成本大幅度增加。而高濃度糖底物耐受是實現纖維素類生物質同步糖化發酵生產乙醇所必須的。

從工業化角度來看，如果能夠篩選到一株耐高糖的嗜熱厭氧桿菌菌株，提高嗜熱厭氧桿菌糖底物濃度耐受性，且性狀穩定，可應用于高濃度糖底物發酵，縮短發酵遲滯期，減少工藝放大成本，這樣才能更適合工業化生產。

發明內容

本發明的目的在于提供一種生產乙醇的菌株及利用該菌株生產乙醇的方法。

將出發菌株嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium?aotearoenseSCUT27/Δldh)P8G0(紅霉素抗性)按照逐步提高糖底物濃度的方法進行培養，重復數代，直到得到在此濃度下能夠在接種6h后菌體OD₆₀₀長至0.6而且性狀穩定。取1mL菌液加到分離培養基中，在厭氧培養箱中培養2-3天，挑取單菌落，在發酵培養基中培養240h后，乙醇終濃度達28.11g/L，轉化率達1.22mol/mol，最后得到能在高濃度底物下能夠正常生長、傳代的突變株P8G3#4(紅霉素抗性)。

上述突變株為長白云嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium?aotearoense)P8G3#4，已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏(簡稱CGMCC)，保藏編號為CGMCC?NO.9000，保藏日期為2014年4月3日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所。

所述P8G3#4菌株為：革蘭氏陽性菌，長桿狀，直徑約0.6-1.0μm，長約2-15μm，顯微鏡下觀察其可翻滾運動。為嚴格厭氧菌，最適生長溫度為55℃，pH?6.3，可利用多種糖底物生長，如葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、海藻糖、木聚糖、葡聚糖等。該菌株的遺傳特性為：乳酸代謝阻斷型突變株，具有紅霉素抗性，紅霉素抗性濃度為20-100ng/μl。能耐受120-150g/L糖底物濃度，細胞內UDP-Gal(UDP-α-D-半乳糖)和1-(5-磷酸-D-核糖)-5-氨基-4-咪唑羧酸(CAIR)積累增加；甘油磷脂代謝途徑中的mtGDP的表達下調。