[發明專利]用于耐四環素大腸桿菌檢測的組合物

有效

• 申請號: 201410453400.8
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104212902B
• 公開（公告）日: 2017-05-10
• 發明（設計）人: 鄭秋月;徐君怡;那晗;曹際娟;戰曉微
• 申請（專利權）人: 鄭秋月;徐君怡;那晗;曹際娟;戰曉微
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/10;C12N15/11
• 代理公司: 大連智慧專利事務所21215
• 代理人: 周志艦

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，涉及食品及生物產品中耐藥性大腸桿菌所攜帶的耐藥基因的檢測，尤其針對大腸桿菌所攜帶耐四環素基因的mPCR檢測。

技術背景

大腸桿菌是常見的可引起人畜共患病的致病菌，食品動物來源的菌株具有耐藥性可能對人類存在巨大的潛在危害，檢測食品源、動物源等的大腸桿菌耐藥性的研究尤為重要。由于細菌耐藥性的研究主要為臨床醫學領域，而對于動物源性及食源性細菌的耐藥性研究起步較晚，且往往由于細菌同時食物鏈傳播給人類，人們對食物鏈的中間環節多著眼于細菌致病性的檢測，而忽略了細菌耐藥性。

在禽畜飼養中，四環素類抗生素被廣泛的應用于對各類細菌性疾病的預防工作中，盲目加大抗生素使用劑量，使四環素在畜禽體內存留時間延長，使休藥期增加。同時在畜產品生產過程也被用于提高家畜的生產性能，作為生長促進劑在飼料中隨意或提高添加四環素；此外，屠宰前使用四環素類抗生素來掩蓋患病家禽臨床癥狀以逃避宰前檢驗。在動物體內或動物性相關食品中過量或大量的四環素殘留，促使細菌產生耐藥性，造成具有耐藥性的病原菌引起人類食物中毒或感染疾病時，藥物無法治療，或耐藥性菌株的耐藥因子(如質粒、整合子等)通過食物鏈等途徑流行傳播，引起菌株耐藥率提高，抗生素失效等嚴重后果。

大腸桿菌對四環素的耐藥性幾乎是所有抗生素中最嚴重的，且有研究表明患病動物體內大腸桿菌分離株的耐藥性明顯高于健康動物分離株，這種現象可能會造成患病動物的治療難度增加，甚至會產生致病菌的耐藥率提高的隱患。因此，檢測四環素耐藥基因，并監控其在動物源性食品的流行情況，以及在其他非動物源性食品流行情況對于預防四環素耐藥菌株對人類及動物造成健康和經濟上的危害，以及了解四環素耐藥基因在大腸桿菌中的攜帶率，甚至是四環素的使用都具有重要意義。牛源大腸桿菌對四環素類藥物的耐藥率為30.5％，豬源大腸桿菌對四環素類藥物耐藥率高達96.3％，研究發現大腸桿菌最常見的耐受藥物是四環素。Bryan等(2004)研究了從美國的人和各種動物體分離的大腸桿菌，發現tetA和tetB是最主要的大腸桿菌四環素耐藥基因，其攜帶率分別為35％和63％。

目前，國內對動物源性細菌耐藥性的方法主要依據臨床和實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)制訂的《動物及其制品中細菌耐藥性的測定紙片擴散法》SN/T1944-2007進行體外細菌培養藥敏性試驗，而缺少快速檢測食品中大腸桿菌耐藥菌株的檢測方法。體外細菌培養藥敏性試驗操作繁瑣，不適于大量樣品的檢測，且只能檢測菌株的耐藥表型，而對于耐藥基因尚未表達的耐藥菌株易造成漏檢。而且完成藥敏鑒定的全自動生化鑒定儀價格昂貴，鑒定結果受操作人員的影響較大，也易造成假性耐藥或假性敏感現象；此外該體外藥敏試驗的結果無法評估細菌耐藥性對人體的危害。因此急需建立更加準確高效的檢測方法，可以快速實現耐藥菌株的鑒別，并可有效避免被測菌株因體外藥敏試驗而產生的假性耐藥或假性敏感現象。

發明內容

本發明的目的之一，在于提供用于耐四環素大腸桿菌檢測的組合物，包括引物對SEQ ID NO.1/2和引物對SEQ ID NO.3/4。

關于這些引物對的描述如下表：

所述組合物被應用于PCR反應，針對性擴增待測樣品中可能含有的目的基因片段，這些目的基因片段包括：大腸桿菌四環素耐藥基因tetA和tetB。

本發明的目的之二在于提供一種用于耐四環素大腸桿菌檢測的試劑盒，包括上述本發明的用于耐四環素大腸桿菌檢測的組合物。

顯然，所述試劑盒可應用于PCR擴增，所述試劑盒中，除了包括上述特異性引物組合物，還可以包括用于PCR反應的其它組分，所述組分包括但不限于Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCR緩沖液以及水。

所述試劑盒試劑盒保存條件：-20℃保存。

本發明再一方面的目的在于提供一種檢測耐四環素大腸桿菌的方法，包括PCR反應的步驟，所述PCR反應使用上文所述本發明的用于耐四環素大腸桿菌檢測組合物為mPCR擴增引物。

具體的實施方案中，本發明的檢測耐四環素大腸桿菌的方法中所述的PCR反應體系總體積25μL，包括：待測樣品DNA溶液1μl，5U/μL的Taq DNA聚合酶0.25μL，PCR反應液12μL和余量的水；