[發明專利]一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產物的引物、方法

有效

• 申請號: 201410452747.0
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104195249B
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 陳發棣;趙楠;陳素梅;蔣甲福;張飛;廖園
• 申請（專利權）人: 南京農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 南京天華專利代理有限責任公司 32218
• 代理人: 徐冬濤

本發明屬于生物技術領域，提供一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產物的引物、方法及二者在菊花上的應用以及該引物在試劑盒上的應用。快速篩選目的基因克隆產物的方法包括：(1)引物設計(2)基因克隆擴增(3)檢測引物篩選基因克隆產物，確定克隆產物對應的基因是否為目的基因。本發明解決了現有技術中，篩選菊花等多倍體植物目的基因克隆產物過程復雜、效率低下的問題。通過本發明提供的檢測引物，每增加1bp長度，篩選目的基因的準確性即提高4倍。例如檢測引物長度為18bp，則在原基礎上篩選度提高了4¹⁸倍。檢測引物為復雜基因組基因的分子克隆提供思路，大大提高了基因克隆的效率。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產物的引物、快速篩選多倍體植物目的基因克隆產物的方法及二者在菊花上的應用以及該引物在試劑盒上的應用。

技術背景

菊花(Chrysanthemum morifolium)原產我國，栽培品種多為六倍體及其非整倍體，是我國十大傳統名花和世界四大切花之一，具有觀賞、食用和藥用價值(李鴻漸，1993)，距今已有1600多年的栽培歷史。菊花花型、花色、株型等極其豐富，是盆栽、切花和園林地被應用的重要花卉種類，具有很高的觀賞和應用價值，在花卉生產中占有十分重要的地位。

菊科作為被子植物第一大科，有1000多個屬，30000余種，是被子植物最成功的類群之一(強盛，2006)。而菊花作為菊科植物的代表，由毛華菊、野菊和紫花野菊等天然雜交并經人工長期選育而成(Chen，1957；Chen，1985)，是典型的異源六倍體。據估計，50％-70％的被子植物在其進化過程中至少經歷過1次多倍化過程(Masterson，1994)。然而，因為其基因組經過多次加倍，伴隨著基因數目的改變而使基因組結構相對復雜，與原基因組相比基因表達水平以及基因組構成發生了顯著的改變，如染色體重組、親本序列的消除、基因沉默、同源異型轉換等(莊勇等，2006)，產生大量的同源基因以及基因拷貝數增加，基因組內的不等交換、反轉錄插入、大規模的染色體片段重復和全基因組重復等多種方式形成基因重復(Zhang，2003)，導致基因冗余、原有基因亞功能化甚至沉默，大大增加了克隆基因的難度。

基因克隆是開展分子育種的關鍵。為了克服基因克隆的難題，多種基因克隆技術應運而生，代表性方法主要有：根據現有基因序列的同源克隆、根據基因表達產物的功能克隆(Bogan等2003)、根據連鎖圖譜的定位克隆或圖位克隆(Arondel等，1992)以及根據表型差異的表型克隆(Jonsson和Weissman，1992)。近些年隨著基因克隆技術的發展，克隆的基因數逐年呈指數增長，但各種方法都各有其局限性，所以人們總是期待基因克隆技術不斷發展和完善(陳喜文等，2006)。有報道稱，菊科植物即使是二倍體也經歷了至少三次染色體加倍的過程，而菊花作為異源六倍體，擁有大量的重復基因，進行基因克隆時，經常會產生大量的非特異性擴增，嚴重限制了基因克隆的效率。因此如何提高克隆的效率，成為了菊花基因克隆的關鍵問題。

發明內容

本發明目的是解決現有技術中，篩選多倍體植物目的基因克隆產物尤其是菊花目的基因克隆產物過程復雜，效率低下的問題，提供一種基于檢測引物快速篩選目的基因克隆產物的引物和方法。

為解決上述問題，本發明通過以下技術方案實現：

1.本發明提供一種快速篩選多倍體植物目的基因克隆產物的引物：當基因片段進行5’RACE反向擴增時，該引物包括反轉錄引物、特異性擴增引物和正、反向檢測引物，引物長度分別為16-30bp，Tm 55-65℃，正向和反向檢測引物相距100-200bp，檢測引物在特異性擴增引物上游；

當基因片段進行3’RACE正向擴增時，該引物包括特異性擴增引物和正、反向檢測引物，引物長度分別為16-30bp，Tm 55-65℃，正向和反向檢測引物相距100-200bp，檢測引物在特異性擴增引物下游；