[發明專利]一株厚垣菌孢普克尼亞菌株及其篩選和應用

有效

• 申請號: 201410451858.X
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104560723B
• 公開（公告）日: 2017-08-22
• 發明（設計）人: 張克勤;王彥利;牛雪梅
• 申請（專利權）人: 云南大學
• 主分類號: C12N1/14
• 分類號: C12N1/14;A01N63/04;A01P5/00;C12R1/645
• 代理公司: 昆明今威專利商標代理有限公司53115
• 代理人: 楊宏珍

技術領域：

本發明涉及一株厚垣菌孢普克尼亞菌株及其篩選和應用，屬于殺線蟲生物資源及微生物菌種技術領域。

背景技術：

植物病原線蟲是一種危害嚴重的植物病害，據報道的植物病原線蟲達200多屬5000余種。植物病原線蟲病害給全世界農業每年帶來近1570億美元的經濟損失，僅次于真菌病害。目前，化學防治仍然是控制植物線蟲的重要措施之一，但長期使用劇毒化學殺線蟲劑給環境和人類的健康帶來的危害日漸顯露。因此，研究開發高效低毒的生物殺線蟲劑已成為農業可持續發展的重要問題。

線蟲生物防治引起了人們的關注，各國政府也給予了極大支持，第一代線蟲生物防治劑的活菌劑如捕食線蟲真菌、內寄生真菌和寄生性細菌應運而生，但它受環境因素影響大、穩定性較差、貨架期短等問題，使其應用受到限制。為克服這一弊病，國內外研究者更加關注第二代線蟲生防因子即菌株代謝產物研究開發。真菌的次生代謝產物作為第二代線蟲生防因子，以直接作用于農作物線蟲的方式發揮作用，有著作用快、藥效高、環境相容性好、不容易造成二次污染等優點。近年來由于線蟲、真菌等造成植物侵染性病害的各種病原物的抗性、原有的農用抗菌素、殺線劑抗生素治療效果在減退，需要不斷開發新的抗生素，而發現新的天然抗生素活性成份是問題的關鍵。

發明內容：

本發明的一個目的在于克服現有殺線蟲劑中存在的不足和殺線蟲劑高效生產菌種資源匱乏的問題，從具有毒殺植物病原線蟲功能的真菌中篩選出具有產生殺線蟲活性的金輪霉素(aurovertins)類次生代謝產物的菌株厚垣菌孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)YMF 1.00613，為研究開發生物殺線蟲制劑和研究開發仿生生物農藥奠定基礎。

本發明第二個目是提供厚垣菌孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)YMF1.00613菌株的篩選方法。

本發明第三個目在于提供厚垣菌孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)YMF1.00613菌株的應用。

為實現上述目的，本發明提供了如下的技術方案:

本發明的厚垣菌孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)YMF 1.00613于2010年5月10日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏單位地址：北京市朝陽區北晨西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No.3806。厚垣菌孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)YMF 1.00613屬于普克尼亞屬(Pochonia spp.)，舊稱輪枝孢屬或輪枝菌屬(Verticillium spp.)。該屬真菌能夠寄生根結線蟲(Meloidogyne spp.)、偽根瘤線蟲(Nacobbus spp.)和胞囊線蟲(Heterodera spp.，Globodera spp.)的卵及雌蟲，能顯著地抑制害蟲繁殖和后代種群數量。

本發明的厚垣菌孢普克尼亞菌(Pochonia chlamydosporia)YMF 1.00613菌株的篩選步驟如下：

(1)菌種的分離純化

將從云南建水煙地采集的根結線蟲侵染煙草病根±300g根結剪成3–5cm小節，放于裝滿水的貝爾曼漏斗裝置，漏斗下方用一橡膠管與線蟲接收試管相接，線蟲在重力作用沉于管底，24小時后，夾住橡膠管，取下接收管，8000rpm離心棄上清，得線蟲懸液1mL；取0.2mL線蟲懸液涂布于2％瓊脂水平板，28℃培養10～20天；當有菌落形成時，自菌落邊緣挑取少許菌絲移至新的PDA平板，培養±7天，觀察長成的菌落形態，進行初步鑒定，并將菌落轉接到CMA平板上純化培養，CMA培養基為：玉米粉30g煮沸30min，過濾得濾液，加入瓊脂15g，加水定容至1L，加熱混勻，分裝后121℃滅菌20分鐘；

(2)菌種的生產金輪霉素(aurovertins)類次生代謝產物的篩選