[發明專利]一種快速檢測薊馬體內番茄斑萎病毒的方法

有效

• 申請號: 201410450554.1
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104198713A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 丁銘;盧訓;尹躍艷;張仲凱
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院生物技術與種質資源研究所
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N33/569;G01N21/78
• 代理公司: 昆明知道專利事務所(特殊普通合伙企業) 53116
• 代理人: 姜開俠

技術領域

本發明屬于檢測技術領域，進一步屬于昆蟲體內病毒檢測技術領域，具體涉及一種快速檢測薊馬體內番茄斑萎病毒的方法。???

背景技術

???????番茄斑萎病毒是一種有害生物，因首先在染病番茄上發現而命名，番茄斑萎病毒的分布范圍很廣，可侵害160種雙子葉植物與10種單子葉植物，因感染該病毒而發生的作物疾病稱為斑萎病。

番茄斑萎病毒（Tomato?spotted?wilt?virus，TSWV）是一種危害農業生產的重要病毒。它的寄主范圍很廣，可侵害160種雙子葉植物與10種單子葉植物，尤其是茄科、菊科和豆科的部分植物。在歐洲、北美、南美、亞洲和大洋洲等多個國家和地區廣泛分布，熱帶、亞熱帶、溫帶地區均有發生。屬于歐洲及地中海植物保護組織（EPPO）A2類檢疫性有害生物，同時也是中國進境植物檢疫性有害生物。

番茄斑萎病毒癥狀變化大，苗期染病，幼葉變為銅色上卷，后形成許多小黑斑，葉背面沿脈呈紫色，有的生長點死掉，莖端形成褐色壞死條斑，病株僅半邊生長或完全矮化或落葉呈萎蔫狀，發病早的不結果。坐果后染病，果實上出現褪綠環斑，綠果略凸起，輪紋不明顯，青果上產生褐色壞死斑，呈瘤狀突起，果實易脫落。成熟果實染病輪紋明顯，紅黃或紅白相間，褪綠斑在全色期明顯，嚴重的全果僵縮，臍部癥狀與臍腐病相似，但該病果實表皮變褐壞死別于臍腐病。

番茄斑萎病毒傳播途徑：汁液可接種，種子也能傳染，此外煙薊馬（Thrips?tabaci）、豆薊馬（T．Setosus）、薊馬（Frankliniella?schutzei）、煙草褐薊馬（F．Fusca）及苜蓿薊馬（F．Occidentatis）等均可進行持久性傳毒。

薊馬只能在幼蟲期獲得病毒。傳毒需要在體內繁殖，蔥薊馬經5～10天變為成蟲后才能傳毒，煙薊馬最短獲毒期為15～30分鐘，豆薊馬需30分鐘，時間長傳毒效率升高，薊馬一旦帶毒，傳毒達20天，具終生傳毒能力。病毒接種多在番茄葉表細胞淺表皮吸食時獲取，一般經4天潛育即發病。番茄、瓜葉菊等外種皮帶毒，不進入胚胎。

此病毒可以通過一些野生植物品種來越冬。但是，病毒流行主要依賴于蟲口密度。最主要的介體昆蟲薊馬的成蟲藏在土壤中，春季土壤溫度上升后，害蟲會遷移到雜草上。因此，開發一種能快速檢測薊馬體內番茄斑萎病毒的方法是非常必要的。

發明內容

本發明的目的在于提供一種快速檢測薊馬體內番茄斑萎病毒的方法。

本發明的目的是這樣實現的，包括前處理、檢測、結果分析步驟，具體包括：

A、前處理：將待測薊馬放置到硝酸纖維素膜上，加入樣品處理PBS緩沖液，磨碎，用同方法處理帶毒薊馬和無毒薊馬，記錄各樣品和陰陽性對照的位置；

B、檢測：將經前處理后的硝酸纖維素膜干燥后，置于容器內，加入封閉液浸沒0.5~1.5h，棄去封閉液，加入用封閉液稀釋的番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，反應0.5~1.5h，棄去番茄斑萎病毒單克隆或多克隆抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素3~4次，再加入用封閉液稀釋的堿性磷酸酶標記的第二抗體，反應0.5~1.5h，棄去堿性磷酸酶標記的第二抗體，用PBST緩沖液洗滌硝酸纖維素膜3~4次，加入顯色緩沖液浸沒5~6min，棄去顯色緩沖液，加入顯色液反應15~30min，棄去顯色液加入蒸餾水終止顯色反應；

C、結果分析：?終止顯色反應后即可進行結果分析，陽性對照樣品上樣液所點斑點顯現黑褐色或紅色，陰性對照樣品上樣液所點斑點無顏色變化時，表明檢測正常完成；檢測樣品上樣液所點斑點顯現黑褐色或紅色，表明該檢測樣品帶有所測病毒，即該檢測樣品中的薊馬帶有所測病毒，檢測樣品上樣液所點斑點無顏色變化，表明該檢測樣品不帶有所測病毒，即該檢測樣品中的薊馬不帶有所測病毒。

本發明操作方便、快速、測定結果有良好的穩定性、重現性和準確性，能滿足薊馬體內番茄斑萎病毒的檢測需要，為盡量避免番茄斑萎病毒的危害奠定了基礎。

附圖說明

圖1為本發明單頭薊馬體內TSWV（番茄斑萎病毒）檢測結果示意圖；

圖2為昆明周邊番茄、辣椒及雜草上薊馬TSWV檢測結果圖。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步的說明，但不以任何方式對本發明加以限制，基于本發明教導所作的任何變換或替換，均屬于本發明的保護范圍。

本發明所述的快速檢測薊馬體內番茄斑萎病毒的方法，包括前處理、檢測、結果分析步驟，具體包括：