[發明專利]一種脂肪酶與其編碼基因和應用

有效

• 申請號: 201410450136.2
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104328132B
• 公開（公告）日: 2016-11-23
• 發明（設計）人: 徐安龍;王磊;任政華;吳珊;陳尚武;鄒瓊;付永貴
• 申請（專利權）人: 中山大學
• 主分類號: C12N15/55
• 分類號: C12N15/55;C12N15/11;C12N15/70;C12N1/21;C12N9/20;C12R1/19
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 華輝

技術領域

本發明涉及基因工程領域，特別是涉及一種脂肪酶與其編碼基因及其應用。?

背景技術

脂肪酶(E.C.3.1.1.3)也稱為三酰基甘油水解酶，是能催化天然底物油脂水解生成脂肪酸、甘油和甘油單酯或二酯的一類特殊酯鍵水解酶類，它廣泛存在于原核生物(如細菌)和真核生物(如霉菌、哺乳動物、植物等)中。研究表明，除了能夠催化甘油酯類化合物的水解和合成之外，它還可以用于催化酯交換反應、生物表面活性劑的合成、多肽合成、聚合物的合成和藥物的合成等，利用某些脂肪酶的立體專一性，還可以催化化學方法難以完成的旋光異構體的拆分和手性藥物的合成。因而脂肪酶在食品和營養、日用化學工業、油脂化學品工業、農業化學工業、造紙工業、洗滌和生物表面活性劑的合成、以及藥物合成等許多領域得到廣泛應用。近年來人們還用含有脂肪酶及其它成分的復合制劑處理海中的石油，使之快速降解為適合微生物的營養成分，隨著酶工程的不斷發展，脂肪酶的應用研究正日益豐富，利用其進行新應用領域的開發也正成為研究熱點。?

作為一種生物催化劑，周圍環境(溫度、pH、有機試劑等)對酶的活性影響很大，很多酶在一些比較苛刻的反映條件下(高溫、低溫或者強酸堿環境)均會失去活性，這就限制了其應用范圍。為了適應更苛刻的工業生產環境需求，需要我們在尊重生物多樣性的前提條件下，不斷在環境中進行新的淀粉酶來源的探索。?

深海熱液口煙囪是通過來自地殼的熔漿與海水相互作用而形成的特殊的地質結構，該環境被認為與地球早期環境相似，為特異微生物群落的形成和演化?提供了良好的環境和物質基礎，使得群落顯示出獨特的極端環境耐受力，蘊藏了大量的生物活性物質。熱液口微生物中具有很多特殊的基因和酶，在現代工業、醫藥、環保、材料、生物工程和國防等領域具有廣闊的開發應用前景。又因其與地球上生命形成初期的環境又十分相似，因此熱液口又被喻為是研究生命起源與進化的天然實驗室。近年來宏基因組學技術體系的建立使從不可培養微生物樣品中直接獲得酶資源成為可能。?

宏基因組學又叫環境基因組學或群體基因組學，是指特定環境中全部生物遺傳物質的總和，利用現代基因組技術直接研究自然生態環境中的有機群落，而不需要分離、培養單一種類的微生物。宏基因組文庫的構建沿用了分子克隆的基本原理和技術方法，然后根據不同環境樣品的特點和建庫目的采取了一些特殊的步驟和策略。其中主要包括以下幾個關鍵因素：DNA提取質量、克隆載體的選擇、宿主菌的選擇。?

發明內容

本發明的目的在于提供一種來源于深海熱液口的淀粉酶基因脂肪酶F_93_ORF6蛋白。?

本發明的另一目的在于提供該F_93_ORF6蛋白的生產方法。?

本發明還有一個目的在于提供上述F_93_ORF6基因編碼的脂肪酶在工業化生產和藥物合成等許多領域的應用。?

本發明公開了一種脂肪酶基因，其核苷酸序列如序列表SEQ?ID?NO.1所示。?

進一步地，本發明公開了用于所述的脂肪酶基因特異性擴增的引物，包括以下兩條序列：?

上游引物見序列表中SEQ?ID?No.3；?

下游引物見序列表中SEQ?ID?No.4；?

進一步地，本發明還公開了所述的脂肪酶基因編碼的脂肪酶，其氨基酸序列序列表SEQ?ID?NO.2所示。?

進一步地，本發明還公開了一種重組表達載體，所述的表達載體含有權利要求1所述核苷酸片段。?

進一步地，所述的重組表達載體，其具體為pET-32a(+)M-F_93?

進一步地，本發明還公開了一種表達工程菌，其攜帶有上述的表達載體。?

進一步地，所述的表達工程菌，其具體為轉化的大腸桿菌菌株BL21(DE3)。?

本發明公開了一種脂肪酶基因F_93_ORF6，其核苷酸片段的序列具體為序列表SEQ?ID?NO.1所示。?

具體地，本發明通過對深海熱液口4143-1宏基因組數據分析發現，共有6條拼接序列與脂肪酶基因有較高的同源性，以這些宏基因組序列信息設計引物，對2880個克隆子進行兩步法篩選，最后篩選得Fosmid克隆子F_93。?