[發(fā)明專利]一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410449666.5
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104212771A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張立霞;李亞杰;郁宏偉;劉濤;楊保收;盛長忠;梁武
• 申請（專利權(quán)）人: 天津瑞普生物技術(shù)股份有限公司
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;A61K39/145;A61K9/107;A61P31/16
• 代理公司: 天津濱海科緯知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 12211
• 代理人: 韓敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及獸用疫苗技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗。

背景技術(shù)

禽流感(Avian?Influenza)是由正粘病毒科甲型流感病毒引起的一種禽類烈性傳染病，被國際獸疫局定為Ⅰ類傳染病。根據(jù)毒株致病性的不同，禽流感可分為高致病性禽流感和低致病性禽流感兩大類。H9亞型禽流感屬于低致病性禽流感，產(chǎn)蛋家禽感染后,可引起產(chǎn)蛋率下降，軟殼蛋、無殼蛋增多，嚴(yán)重的將會停止產(chǎn)蛋。種禽感染后，除上述癥狀外，還表現(xiàn)出受精率下降，孵化初期死胚增多，孵化后期雛禽出殼困難，出殼后的雛禽弱雛增多。雛禽在一周內(nèi)死亡率較高，且易感染大腸桿菌，治療較困難。H9亞型禽流感混合感染其他病原時，可導(dǎo)致發(fā)病率和死亡率的大幅度提高，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大損失。

疫苗接種是預(yù)防和控制流感病毒流行的最有效手段。目前，控制禽流感病毒發(fā)病的主要手段是接種滅活全病毒疫苗，其生產(chǎn)主要依靠雞胚法實現(xiàn)。為了提高滅活疫苗的免疫原性，必須提高疫苗制備時抗原的含量，故如何提高病毒滴度成為關(guān)鍵環(huán)節(jié)。現(xiàn)在，提高流感病毒含量的方法主要通過濃縮的方法實現(xiàn)，這樣將提高疫苗制備的成本，使疫苗制備過程復(fù)雜化，并且增加了病毒液的損失和污染風(fēng)險。

發(fā)明內(nèi)容

為克服現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種禽流感病毒增殖方法及利用該方法制備的禽流感疫苗，旨在節(jié)約疫苗制備成本，提升生產(chǎn)效率。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種禽流感病毒增殖方法，包括以下步驟：

1)對禽流感病毒進(jìn)行復(fù)蘇處理；

2)將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行梯度稀釋，以各稀釋度病毒液接種雞胚，再取全部受感染雞胚尿囊液中其HA效價排名處于前10％或前20％的尿囊液作為種子批；

3)將步驟2)得到的種子批分別接種雞胚并傳代6～10代，將各代次受感染雞胚尿囊液中EID₅₀指標(biāo)≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的種子批作為基礎(chǔ)種子批；

4)將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批接種雞胚，增殖禽流感病毒。

優(yōu)選的，步驟1)所述的復(fù)蘇處理包括以下流程：取出凍存的禽流感病毒，進(jìn)行10^-3～10^-4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，36.5～37.5℃培養(yǎng)，收獲24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，傳2～3代，收獲24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液即為復(fù)蘇處理完畢的病毒液。

優(yōu)選的，步驟2)具體包括以下流程：將步驟1)復(fù)蘇處理完畢的病毒液進(jìn)行10倍系列稀釋，分別取稀釋度為10^-7、10^-8、10^-9、10^-10、10^-11的病毒液接種雞胚，每個稀釋度接種若干雞胚，接種量為0.08～0.12mL，36.5～37.5℃孵育，分別收集接種后24-96h死亡胚和96h未死雞胚尿囊液，測定HA效價并以HA效價≥(1:256)認(rèn)定為雞胚已感染病毒，在已感染病毒的雞胚尿囊液中選取由最大稀釋倍數(shù)病毒液接種雞胚得到的尿囊液1～2例作為后續(xù)傳代用病毒液，以此重復(fù)上述稀釋、篩選步驟3～5代，每代、每例尿囊液分別保存，將其中HA效價排名處于前10％或前20％的尿囊液作為種子批；

優(yōu)選的，步驟3)具體包括以下流程：將步驟2)得到的種子批進(jìn)行10^-3～10^-4稀釋，接種10日齡SPF雞胚，36.5～37.5℃培養(yǎng)，收獲24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液，再傳6～10代，收獲24～96h死亡胚和96h活胚尿囊液從中篩選病毒含量≥10^-9.0EID₅₀/0.1mL的尿囊液作為基礎(chǔ)種子批。

優(yōu)選的，步驟4)具體包括以下流程：將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批進(jìn)行10^-3-10^-6稀釋，接種雞胚，收獲24～96h雞胚尿囊液即為病毒液；進(jìn)一步的，可以優(yōu)選為以下流程：將步驟3)得到的基礎(chǔ)種子批進(jìn)行10^-4-10^-5稀釋，接種雞胚，收獲65～75h雞胚尿囊液即為病毒液。

優(yōu)選的，步驟1)所述的禽流感病毒為H9亞型禽流感病毒。