[發(fā)明專利]一種腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410448754.3
• 申請日: 2014-09-05
• 公開（公告）號: CN104198706A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊占軍;簡志琴;李娟
• 申請（專利權(quán)）人: 揚州大學(xué)
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574;G01N27/30
• 代理公司: 揚州市錦江專利事務(wù)所 32106
• 代理人: 江平

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于電化學(xué)免疫分析技術(shù)領(lǐng)域，特別是腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫檢的測技術(shù)方法。

背景技術(shù)

腫瘤標(biāo)志物是指在惡性腫瘤細(xì)胞增殖過程中，由基因表達并合成分泌的一類物質(zhì)。它們一般存在于腫瘤細(xì)胞和組織中，有時也能在血液或其他體液中檢測到。理想的腫瘤標(biāo)記物應(yīng)具有高特異性，適于人群普查。腫瘤標(biāo)志物的血清篩查可以簡便地診斷癌癥。就肝癌而言，甲胎蛋白(AFP)仍是特異性最強的標(biāo)志物和診斷肝癌的主要指標(biāo)。現(xiàn)已經(jīng)廣泛用于肝細(xì)胞癌的普查、診斷和判斷治療效果、預(yù)測復(fù)發(fā)。正常成人血清中AFP含量很少，高于20?ng/ml就有患肝腫瘤的可能，因此，檢測痕量AFP具有重要意義。

目前常用于檢測腫瘤標(biāo)志物的技術(shù)是免疫學(xué)技術(shù)。電化學(xué)免疫因儀器便攜、靈敏度度高、操作簡單等因而被廣泛用于腫瘤標(biāo)志物的檢測。生物素-親和素標(biāo)記技術(shù)（Biotin-Avdin?System，BAS）是免疫標(biāo)記技術(shù)的一種，因為生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)的高特異性，且四個生物素可與一個鏈酶親和素結(jié)合，由此將信號放大。

近年來，納米材料逐步應(yīng)用到生物傳感器的領(lǐng)域中。納米材料由于其比表面積大、導(dǎo)電性好、生物相容性高等優(yōu)點被引入到電化學(xué)免疫傳感器中。納米材料的生物功能化可以提高它的生物相容性和生物識別能力。因此，利用鏈霉親和素將納米結(jié)構(gòu)材料進行生物功能化，建立一個基于鏈霉親和素功能化半導(dǎo)體納米材料的電化學(xué)免疫分析方法檢測腫瘤標(biāo)志物，對腫瘤的早期診斷有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于：在一般的電化學(xué)免疫方法的基礎(chǔ)上，提出一種引入生物素-親和素放大系統(tǒng)，建立快速、簡便的檢測方法，以期提高靈敏度，降低檢出限。

本發(fā)明包括以下步驟：

1）將花狀形貌的硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料分散于水中制成硫化鉍水溶液，然后將硫化鉍水溶液與鏈霉親和素混合，取得硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料/鏈霉親和素的混合溶液；

2）取硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料/鏈霉親和素的混合溶液滴涂于潔凈的玻碳電極表面，置于4℃的溫度環(huán)境下干燥后，再在玻碳電極表面均勻地修飾一層Nafion膜，再采用牛血清蛋白封閉活性位點，然后滴入生物素化抗體，即制得腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器。

?????本發(fā)明通過選用具有優(yōu)良性能的特殊形貌半導(dǎo)體材料——花狀形貌的硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料，利用鏈霉親和素將其生物功能化而制得了一種基于鏈霉親和素功能化的硫化鉍半導(dǎo)體納米材料的腫瘤標(biāo)志物電化學(xué)免疫傳感器。制成的免疫傳感器，利用夾心免疫反應(yīng)，引入生物素-鏈酶親和素系統(tǒng)，可為腫瘤標(biāo)志物檢測

提供一種快速、高靈敏、信號放大電化學(xué)免疫分析系統(tǒng)檢測腫瘤標(biāo)志物的方法。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下優(yōu)點：

（1）納米結(jié)構(gòu)材料因其比表面積大、生物相容性高、吸附能力強、表面活性高等優(yōu)點，可以利用鏈霉親和素將其進行生物功能化，來提高穩(wěn)定性和重復(fù)性。

（2）每個親和素可結(jié)合4個生物素，可使反應(yīng)信號明顯放大。此在一般的電化學(xué)免疫方法的基礎(chǔ)上引入生物素-親和素放大系統(tǒng)建立快速、簡便的檢測方法，以期提高靈敏度，降低檢出限。

所述步驟1）中，所述硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料與水的混合質(zhì)量比為1：1。

所述鏈霉親和素的濃度為200μg/mL，所述鏈霉親和素與硫化鉍水溶液的混合體積比為1：1。

另外，所述潔凈的玻碳電極的處理方法是：取玻碳電極，先用粒徑不大于0.05?mm的氧化鋁粉拋光，再用去離子水沖洗掉殘留的氧化鋁粉后，?再放入稀硝酸水溶液中超聲清洗，最后依次用乙醇和二次蒸餾水清洗電極表面，取得清潔的玻碳電極。

為了有效去除表面殘留的氧化鋁和其它雜質(zhì)，所述稀硝酸溶液是由體積比為1:1的硝酸和水混合形成的稀硝酸水溶液。

附圖說明

圖1為本發(fā)明腫瘤標(biāo)志物免疫傳感器制備及免疫分析示意圖。

圖2為免疫傳感器在不同濃度甲胎蛋白抗原的溫育液中溫育40?min后在含0.5mM硫堇和5.0mM過氧化氫的pH為7.0的PBS中的差分脈沖伏安曲線。

圖3為電流與甲胎蛋白抗原濃度的線性關(guān)系圖。

具體實施方式

下面對本發(fā)明的實驗過程進行詳細(xì)的說明，旨在使本發(fā)明的設(shè)計流程、設(shè)計目的及其創(chuàng)新點和優(yōu)點更加明了。

實施例1，如圖1所示：

（1）取1?mg花狀形貌硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料超聲分散分散于1?mL水中，得到硫化鉍水溶液，然后將40μL硫化鉍水溶液和40μL濃度為?200μg/mL的鏈霉親和素混合，得到硫化鉍納米結(jié)構(gòu)材料/鏈霉親和素的混合溶液。