[發(fā)明專利]一種肌鈣蛋白I致敏微球的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410448233.8
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104198696A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 譚柏清;王進(jìn);甘宜梧;王綺;李靜
• 申請（專利權(quán)）人: 山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司
• 主分類號: G01N33/531
• 分類號: G01N33/531
• 代理公司: 濟(jì)南泉城專利商標(biāo)事務(wù)所 37218
• 代理人: 張世靜

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種高活性抗肌鈣蛋白I抗體致敏微球的制備方法。

背景技術(shù)

肌鈣蛋白是由3個亞單位，即肌鈣蛋白C、肌鈣蛋白I及肌鈣蛋白T組成的復(fù)合物。肌鈣蛋白(cTn)被認(rèn)為是目前用于ACS診斷最特異的生化marker，它們出現(xiàn)早，最早可在癥狀發(fā)作后2h出現(xiàn)；具有較寬的診斷窗：cTnT(5～14天)，cTnI(4～10天)。在它們的診斷窗中，cTn增高的幅度要比CK-MB高5～10倍。由于在無心肌損傷時cTn在血液中含量很低，因此也可用于minor?mycardial?damage(MMD，微小心肌損傷)的診斷，這是以前酶學(xué)指標(biāo)所難以做到的。cTn還具有判斷預(yù)后的價值，對任何冠狀動脈疾患病人，即便ECG或其他檢查(如運動試驗)陰性，只要cTn增高，應(yīng)視為具有高危險性。

心肌肌鈣蛋白I(cardiac?troponin?I，CTnI)是一項新的心肌損傷的特異性和敏感性指標(biāo)，同其它檢測指標(biāo)相比，CTnI在血液中出現(xiàn)早、持續(xù)時間長、特異性強(qiáng)，作為心肌輕度受損的指標(biāo)，對急性心肌梗死(acute?myocardial?infarction，AMI)、不穩(wěn)定型心絞痛(unstable?angina?Oectoris，UAP)、圍手術(shù)期心肌損傷等疾病的診斷、病情監(jiān)測、療效觀察及預(yù)后評估都具有較高的臨床價值。

Tnl存在三種不同的亞基，即慢收縮骨骼肌TnI、快收縮骨骼肌TnI和心肌收縮Tnl(CTnI)，分別有三種不同基因編碼，快、慢收縮骨骼肌TnI與CTnI在氨基酸排列順序上僅有4％相同，且后者比前者在N末端多31個氨基酸殘基。前者分子量為19.8?kDa，后者為225?kDa，不同組織來源的TnI有組織特異性而無種屬特異性，而CTnI僅存在于心房肌和心室肌中，且只有一種TnI存在，胎兒、新生兒及成年人各階段的CTnI均相同，所以CTnI是一種理想的心肌細(xì)胞特異性標(biāo)志。在心肌細(xì)胞膜完整時CTnI不能透過細(xì)咆膜進(jìn)人血循環(huán)，當(dāng)心肌細(xì)胞因缺血缺氧而發(fā)生變性壞死時，CTnI可通過破損的細(xì)胞膜彌散進(jìn)人細(xì)胞間質(zhì)，隨之進(jìn)人血管和淋巴管中。由于CTnI分子量較小，并持續(xù)從變性細(xì)胞內(nèi)逸出，心肌損傷后CTnI3～6?h開始升高，14～20?h達(dá)高峰，血中可持續(xù)5～7天，故CTnI作為心肌損害的指標(biāo)有較高特異性。

肌鈣蛋白I（CTnI）檢測方法主要有：放射免疫法（RIA）、酶免疫測定法（ELISA）、酶免疫化學(xué)發(fā)光法（CLIA）、膠乳增強(qiáng)免疫比濁法?，F(xiàn)在放射免疫法存在輻射，酶免疫測定法靈敏度較差，而酶免疫化學(xué)發(fā)光法成本較高，所以膠乳增強(qiáng)免疫比濁法結(jié)合全自動生化分析儀進(jìn)行檢測的方法，最為常見。其原理為將特異性抗體結(jié)合于膠乳顆粒表面，制備致敏微球，樣本與致敏微球顆粒在緩沖液中混合，樣本中的TnI與致敏微球顆粒表面的抗體結(jié)合，使相鄰的致敏微球顆粒彼此交聯(lián)，在505nm波長下檢測溶液濁度變化，變化程度與樣本中的TnI含量成正比。

常規(guī)方法制備致敏微球顆粒的方式有物理吸附法和化學(xué)交聯(lián)法，但是兩種方法都會影響抗肌鈣蛋白I（CTnI）抗體的免疫活性，而且一些非特異性吸附造成本底較大，嚴(yán)重影響了抗肌鈣蛋白I（CTnI）抗體致敏微球的應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

針對于上述常規(guī)方法制備抗肌鈣蛋白I（CTnI）抗體致敏微球顆粒方法存在的問題，本發(fā)明提供了一種高活性抗肌鈣蛋白I抗體致敏微球的制備工藝，應(yīng)用本制備工藝獲得的抗肌鈣蛋白I抗體致敏微球作為原材料配制的肌鈣蛋白I檢測試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法），檢測試劑的空白吸光度變化比常規(guī)的試劑要低，有利于提高臨床檢測肌鈣蛋白I的靈敏度，與化學(xué)發(fā)光檢測的結(jié)果具有高度的一致性（相關(guān)系數(shù)r≥0.990），保證了試劑盒的準(zhǔn)確度。

本發(fā)明是通過以下措施實現(xiàn)的：

一種高活性肌鈣蛋白I致敏微球的制備工藝，其操作流程如下：

（1）膠乳微球顆粒與親和素結(jié)合：選擇粒徑為70-140nm的聚苯乙烯微球，均勻分散到pH為6.0-7.0的0.05M的MES緩沖液中，微球濃度為0.5-5%，加入親和素，最終濃度為1-10%，在37℃恒溫箱中震蕩孵育2小時，用真空冷凍離心機(jī)離心，15000r/min離心20min，用濃度為0.05M，?pH為7.4的PBS緩沖液進(jìn)行分散，使結(jié)合了親和素的膠乳微球顆粒濃度為5‰；