[發明專利]金黃色葡萄球菌裂解蛋白的制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201410447144.1
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104211781A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 朱文壯;劉勇;宋世燕;楊春江;孟賡;秦堃;莫勛;馬孝斌
• 申請（專利權）人: 北京納百景弈生物科技有限公司
• 主分類號: C07K14/01
• 分類號: C07K14/01;C12N15/70;C12Q1/18;A61K38/16;A61P31/04;A01N47/44;A01P1/00;C12R1/445
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技術領域

本發明涉及一系列新型的金黃色葡萄球菌裂解蛋白的制備，該系列蛋白可以用于治療金黃色葡萄球菌感染引起的一系列疾病，還可以作為醫療外用消毒劑及添加劑使用，屬于醫學、獸醫學及醫療器械類生物制劑領域。

背景技術

金黃色葡萄球菌屬于革蘭氏陽性球菌，在環境中廣泛存在，是醫院內感染的重要病原菌之一，也是引起奶牛乳腺炎等的主要致病菌之一。金黃色葡萄球菌具有較強的抵抗力，在臨床治療中發現，金黃葡萄球菌對青霉素、金霉素、紅霉素和慶大霉素高度敏感，但易產生耐藥性；對鏈霉素中度敏感；但對磺胺、氯霉素敏感性差。

目前臨床上普遍發現多種耐藥菌株，對多種抗生素藥物耐藥，新出現的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)幾乎可以抵抗所有的抗生素，被稱為超級細菌，已成為醫院內感染最常見的致病菌。耐藥菌株導致感染治療困難，病死率較高，已成為全球公共衛生體系的重大危害。畜牧業中，耐藥金黃葡萄球菌引起的牛乳腺炎給奶牛養殖業造成的極大的損失，現在依然沒有很有效的解決方法。因此，發展新的抗菌分子已刻不容緩。

噬菌體是以細菌為宿主的病毒，噬菌體有嚴格的宿主特異性，可以高效、特異性裂解宿主細菌，高效安全，對哺乳動物不具備侵染性。目前，臨床上已經應用噬菌體治療某些疾病。噬菌體裂解細菌的機制是噬菌體侵染宿主細菌，釋放遺傳信息，控制宿主細胞代謝，合成噬菌體自身的遺傳信息和蛋白，在宿主體內組裝成新的噬菌體。通過合成的裂解蛋白將宿主細胞壁裂解，細菌滲透壓改變，細胞破碎，噬菌體釋放。細菌噬菌體裂解蛋白具有高效、特異及不產生耐藥菌株等特點。

細菌裂解蛋白序列和結構具有保守性，主要有兩部分組成：一部分為催化結構域，另一部分為細胞壁結合結構域。細菌裂解蛋白通過細胞壁結合結構域特異性結合到細菌的細胞壁上，催化結構域特異性的識別細胞壁肽聚糖的切割位點裂解細胞壁，細菌由于細胞壁破裂，導致細菌內部滲透壓過大，細胞膜破裂，細菌死亡。細菌裂解蛋白具有高效、特異，不易產生耐藥菌株等特點，并且作用完畢后最終代謝成氨基酸，無毒無害，是替代抗生素的最佳候選之一，因此具有很重要的臨床應用價值。

目前原核系統表達細菌裂解蛋白具有表達量低、可溶性差及活性弱等缺點，不利用大規模的工業化生產。經過大量的篩選，本發明涉及的金黃色葡萄球菌裂解蛋白克服了以上缺點，更加利于大規模的工業生產和臨床應用。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明提供一系列金黃色葡萄球菌裂解蛋白的制備，檢測以及該系列蛋白的應用。

發明概述

本發明通過篩選潛在編碼金黃色葡萄球菌裂解蛋白基因，成功得到3個可純化金黃色葡萄球菌裂解蛋白，并且都有活性，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1，SEQ?ID?NO.2，SEQ?ID?NO.3所示，其對應的名稱分別為SAly100、SAly102、SAly110。本發明制備的金黃色葡萄球菌裂解蛋白可以高效、特異裂解宿主細菌，不易產生耐藥菌株，并且無毒無害，是抗生素的最佳替代品之一，可以用于治療金黃色葡萄球菌感染引起的疾病，并可用作醫療消毒劑和添加劑。

發明詳述

本發明的技術方案如下：

一、金黃色葡萄球菌裂解蛋白

一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.1所示的氨基酸序列。

一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.2所示的氨基酸序列。

一種金黃色葡萄球菌裂解蛋白，其序列為SEQ?ID?NO.3所示的氨基酸序列。

二、金黃色葡萄球菌裂解蛋白的制備方法

本發明還提供了金黃色葡萄球菌裂解蛋白的制備方法，通過基因工程的方法獲得，其步驟包括：

(1)首先進行人工基因合成，同時根據基因序列設計合成一對引物，在引物中引入酶切位點NdeI和XhoI，以合成的基因為模板，用合成的引物進行基因擴增，擴增程序如下：94℃預變性2min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min30s，32個循環，72℃延伸5min，得到的基因擴增產物用0.8％瓊脂糖凝膠電泳，通過百泰克膠回收試劑盒回收基因擴增產物；