[發明專利]提高胚胎耐熱性的培養液及其使用方法

有效

• 申請號: 201410446860.8
• 申請日: 2014-09-04
• 公開（公告）號: CN104152404B
• 公開（公告）日: 2017-05-24
• 發明（設計）人: 田文儒;趙園;叢霞;曹榮峰;李華濤;姜忠玲;崔凱;齊曉楠
• 申請（專利權）人: 青島農業大學
• 主分類號: C12N5/073
• 分類號: C12N5/073
• 代理公司: 青島聯信知識產權代理事務所37227
• 代理人: 傅培

1.提高胚胎耐熱性的培養液，所述提高胚胎耐熱性的培養液以常規培養液為基質，所述常規培養液為用于胚胎培養的培養液，其特征在于：所述提高胚胎耐熱性的培養液中還包括黃芩苷和谷氨酰胺；所述黃芩苷的濃度為2.0～10.0μg/mL，所述谷氨酰胺的濃度為1.17～1.75mg/ml；所述胚胎為牛胚胎或小鼠胚胎；所述牛胚胎的常規培養液為SOF培養液，所述小鼠胚胎的常規培養液為CZB培養液。

2.根據權利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養液，其特征在于：所述牛胚胎由奶牛卵母細胞體外成熟培養、體外受精獲得，所述小鼠胚胎由昆明系小鼠輸卵管沖取獲得。

3.根據權利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養液的配制方法，其特征在于：包括以下幾個步驟：①準確稱取2.0～10.0mg黃芩苷，將其溶于10mL常規培養液；②取1ml步驟①得到的溶液，采用常規培養液定容至100ml；③向步驟②得到的培養液中加入1.17～1.75mg的谷氨酰胺，攪拌均勻，經0.22μm濾器過濾除菌，即得到提高胚胎耐熱性的培養液；4℃溫度條件下儲存，備用。

4.根據權利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養液的使用方法，其特征在于：包括以下幾個步驟：

①預平衡：將所述提高胚胎耐熱性的培養液制作成多個體積為60μL的培養微滴，覆蓋礦物油，然后置于含5％CO₂飽和濕度、溫度條件為41℃的CO₂培養箱中平衡不少于2小時，使所述提高胚胎耐熱性的培養液的氧含量、二氧化碳含量和溫度接近胚胎在體內的液體壞境；

②胚胎移入：取常規SOF培養液200μL于離心管中，將牛胚胎移入其中，震蕩去除顆粒細胞；

③胚胎培養：將步驟②得到的胚胎采用常規SOF培養液充分洗滌，然后移入步驟①得到的培養微滴中；并將培養微滴置于含5％CO₂飽和濕度、溫度條件為41℃的CO₂培養箱中培養，每隔48小時半量更換培養液。

5.根據權利要求4所述的提高胚胎耐熱性的培養液的使用方法，其特征在于：所述牛胚胎由奶牛卵母細胞體外成熟培養、體外受精獲得。

6.根據權利要求1所述的提高胚胎耐熱性的培養液的使用方法，其特征在于：包括以下幾個步驟：

①預平衡：將所述提高胚胎耐熱性的培養液制作成多個體積為60μL的培養微滴，覆蓋礦物油，然后置于含5％CO₂飽和濕度、溫度條件為39℃的CO₂培養箱中平衡不少于4小時，使培養液的氧含量、二氧化碳含量和溫度接近胚胎在體內的液體壞境；

②胚胎移入：將小鼠胚胎移入含透明質酸酶的Hepes-CZB培養液中去除顆粒細胞；

③胚胎培養：將步驟②得到的胚胎采用Hepes-CZB培養液充分洗滌，然后移入步驟①得到的培養微滴中；并將培養微滴置于含5％CO₂飽和濕度、溫度條件為39℃的CO₂培養箱中培養，待胚胎發育至4細胞時移入含有1％葡萄糖的所述提高胚胎耐熱性的培養液中，每24h換液一次，直至胚胎發育至囊胚期。

7.根據權利要求6所述的提高胚胎耐熱性的培養液的使用方法，其特征在于：所述小鼠胚胎由昆明系小鼠輸卵管沖取獲得。