[發(fā)明專(zhuān)利]一種竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶基因及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410441707.6
• 申請(qǐng)日: 2014-09-01
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN104212787A
• 公開(kāi)（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 黃璐琦;陳平;張紹鵬;楊濤;朱聞君;宋佳;孫巧;伍翀;鄭用璉;鄧琛
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黃璐琦;陳平;張紹鵬;楊濤;朱聞君;宋佳;孫巧;伍翀;鄭用璉;王如峰;鄧琛;陳超
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/90
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/90;C12N15/61;C12N15/82;A01H5/00
• 代理公司: 武漢宇晨專(zhuān)利事務(wù)所 42001
• 代理人: 王敏鋒

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，主要涉及竹節(jié)參中β-香樹(shù)素合酶(β-amyrin?synthase)基因的克隆和應(yīng)用，

背景技術(shù)

竹節(jié)參(Panax?japonicus?C.A.Mey)屬于五加科人參屬(Panax?L.)植物是傳統(tǒng)的名貴中藥材之一，具有較高的藥用價(jià)值，如增強(qiáng)人體免疫力、抗腫瘤、抗病毒、抗疲勞以及保護(hù)心肌等作用，其主要有效成分為皂苷類(lèi)化合物，其中以齊墩果烷型五環(huán)三萜類(lèi)皂苷為主，同時(shí)含有少量達(dá)瑪烷型四環(huán)三萜類(lèi)皂苷。

竹節(jié)參是中國(guó)藥典收載品種，具有廣闊的應(yīng)用前景和可觀的經(jīng)濟(jì)價(jià)值,目前中國(guó)竹節(jié)參的野生資源近于瀕危，人工栽培藥材生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，造成目前市場(chǎng)供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。通過(guò)研究竹節(jié)參中活性成分三萜皂苷生物合成的途徑及其調(diào)控的分子機(jī)制，找出其中的關(guān)鍵酶，實(shí)現(xiàn)其基因的定位、克隆及高效表達(dá)，在分子水平上對(duì)三萜皂苷生物合成進(jìn)行人工調(diào)控，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)三萜皂苷類(lèi)化合物的規(guī)模生產(chǎn)，以提供醫(yī)藥市場(chǎng)的需求。

β-香樹(shù)素合酶(β-amyrin?synthase，βAS)基因在三萜類(lèi)皂苷的生物合成途徑中起著重要的作用。βAS催化2，3-氧化角鯊烯生成β-香樹(shù)素，β-香樹(shù)素再經(jīng)一系列生化反應(yīng)生成齊墩果烷型皂苷。βAS被公認(rèn)為是控制2，3-氧化角鯊烯流向齊墩果烷型皂苷合成途徑的關(guān)鍵酶。

本研究首次利用第二代Solexa?HiSeq2000進(jìn)行竹節(jié)參全株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及De?novo拼接。分析找到竹節(jié)參中編碼β-香樹(shù)素合酶的候選基因并進(jìn)行體外克隆表達(dá)，驗(yàn)證其功能，為竹節(jié)參齊墩果烷型皂苷化合物的生物合成提供理論基礎(chǔ)。

在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開(kāi)報(bào)道過(guò)本專(zhuān)利申請(qǐng)中所提及的竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶基因及其氨基酸序列，此基因編碼的酶在竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷化合物的生物合成的過(guò)程中有重要的作用，本研究認(rèn)為體外克隆該基因是利用基因工程方法和技術(shù)來(lái)調(diào)控竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷化合物生物合成的關(guān)鍵點(diǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示。該基因編碼的酶是直接催化2，3-氧化角鯊烯行成β-香樹(shù)素，而β-香樹(shù)素為齊墩果烷型皂苷的前體，進(jìn)而為人參屬植物中齊墩果烷型皂苷含量的積累提供技術(shù)手段。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因編碼的蛋白質(zhì)，其序列為SEQ?ID?NO.2所示。

本發(fā)明的最后一個(gè)目的在于提供一種竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因在提高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷含量的應(yīng)用，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化將其導(dǎo)入到竹節(jié)參中，提高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷的含量。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：

一種竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因(以下稱(chēng)為PJβAS基因)，其制備方法如下：

利用正向引物P1:5'ATGTGGAAGCTTAAGATAGCGGA3'；反向引物P2:5'TTAGGTGCCAAGGGACGGTGAT3'，以竹節(jié)參cDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃預(yù)變性5min，94℃變性40s，54℃退火1min，72℃延伸90s，40個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。

最終獲得了PJβAS基因，其序列為SEQ?ID?NO.1所示，編碼的蛋白質(zhì)為SEQ?ID?NO.2所示。

一種竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因在提高竹節(jié)參中齊墩果烷型皂苷含量的應(yīng)用，其應(yīng)用過(guò)程如下：

將竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶蛋白質(zhì)(SEQ?ID?NO.2所示)對(duì)應(yīng)的PJβAS基因(優(yōu)選SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列)通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入珠子參，可獲得高齊墩果烷型皂苷含量的的轉(zhuǎn)基因植株。

本發(fā)明的所要保護(hù)的內(nèi)容還包括：

編碼SEQ?ID?NO.2所示氨基酸的核苷酸序列；優(yōu)選SEQ?ID?NO.1所示的核苷酸序列。

含有本發(fā)明的竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的重組載體，如原核類(lèi)載體，真核類(lèi)表達(dá)載體及RNAi載體均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，包括但不限于pBI121，pCAMBIA1301。

含有本發(fā)明的竹節(jié)參β-香樹(shù)素合酶(PJβAS)基因全序列或其ORF序列的宿主細(xì)胞，如含有上述的重組載體的宿主細(xì)胞也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。包括但不限于煙草細(xì)胞大腸桿菌細(xì)胞、農(nóng)桿菌細(xì)胞、酵母細(xì)胞、竹節(jié)參細(xì)胞或竹節(jié)參發(fā)根細(xì)胞。