[發明專利]一種利用枯草桿菌生產重組α-環糊精葡萄糖基轉移酶的方法

無效

• 申請號: 201410440327.0
• 申請日: 2014-09-01
• 公開（公告）號: CN104212776A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發明（設計）人: 張佳瑜;吳敬;吳丹;陳晟;陳堅
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12R1/125
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用枯草桿菌生產重組α-環糊精葡萄糖基轉移酶(簡稱α-CGT酶)的方法，其特征在于包括如下步驟：

(1)構建軟化芽孢桿菌α-CGT酶重組枯草桿菌基因工程菌；

(2)優化發酵條件得到培養基關鍵組分麥芽糖，玉米淀粉和酵母粉最佳濃度分別為：15.5g/L，13g/L和20g/L，將重組枯草桿菌接種于該培養基，搖瓶培養36h后離心收集上清液。

2.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組α-CGT酶的方法，其特征在于步驟(1)構建含有軟化芽孢桿菌α-CGT酶基因cgt的重組枯草桿菌基因工程菌的方法為：

I.克隆cgt基因及其自身信號肽的片段：

以軟化芽孢桿菌(Peanibacillus?macerans)JFB05-01為模板，以P1,P2為引物擴增得到cgt基因及其自身信號肽的片段；

正向引物P1：5′-ACGAGGAATTCATGAAATCGCGGTAC-3′(含EcoR?I酶切位點)

反向引物P2：5′-CGCGGATCCTTAATTTTGCCAGTCCAC-3′(含BamH?I酶切位點)

PCR反應體系：dNTPs?5μL，10×Ex?Taq?buffer(Mg2+Plus)5μL，正向引物P1(10μM)1μL，反向引物P2(10μM)1μL，模板1μL，Ex?Taq?HS(5U/μL)0.25μL，加入ddH2O補足50μL。

PCR反應條件：94℃預變性4min，94℃變性45s，60℃退火45s，72℃延伸2.2min，30個循環后，再于72℃延伸10min。擴增得到目的基因PCR片段，割膠回收，回收片段與pMD18-T?simple載體連接，連接產物轉化大腸桿菌JM109，轉化產物涂布含100mg/L氨芐青霉素的LB平板，經37℃培養過夜，挑選菌落，接入LB液體培養基，8-10h后提取質粒，將此質粒進行序列測定。

II.構建重組質粒pGJ-cgt：

用于構建表達載體的質粒是pGJ103，含麥芽糖誘導型啟動子，將該質粒和擴增的目的基因進行EcoR?I和BamH?I雙酶切，酶切產物割膠回收后再用T4連接酶于16℃連接過夜，連接產物轉化E.coli感受態細胞，經37℃培養過夜，挑選轉化子于100mg/L氨芐青霉素LB進行液體培養，然后抽提質粒，得到富集的重組質粒pGJ-cgt；

III.構建含重組質粒pGJ-cgt的枯草桿菌基因工程菌：

將重組質粒pGJ-cgt轉化枯草桿菌WB600得到含有軟化芽孢桿菌α-CGT酶基因的重組枯草桿菌基因工程菌。

3.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組α-CGT酶的方法，其特征在于步驟(2)中誘導劑麥芽糖的最佳濃度為15.5g/L。

4.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組α-CGT酶的方法，其特征在于步驟(2)中碳源為玉米淀粉，最佳濃度為13g/L。

5.根據權利要求1所述的利用枯草桿菌生產重組α-CGT酶的方法，其特征在于步驟(2)中氮源為酵母粉，最佳濃度為20g/L。