[發明專利]白化病模型豬的重構卵及其構建方法和模型豬的構建方法

有效

• 申請號: 201410438927.3
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN104263754B
• 公開（公告）日: 2017-03-08
• 發明（設計）人: 賴良學;信吉閣;楊化強;鄒慶劍;樊娜娜
• 申請（專利權）人: 中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N5/10;A01K67/027
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司44224
• 代理人: 李海恬,萬志香

1.一種白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟一：針對豬物種的酪氨酸酶基因的第一外顯子的正鏈及互補鏈上滿足G(N)₁₉NGG序列模式的序列部分分別設計gRNA的識別序列，分別記為第一gRNA識別序列和第二gRNA識別序列，其中，所述第一gRNA識別序列與所述第一外顯子的正鏈上序列G(N)₁₉一致，所述第二gRNA識別序列與所述第一外顯子的互補鏈上序列G(N)₁₉一致，N為A、T、C或G，下標19表示N的個數；

步驟二：分別對所述第一gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列，以構建含有所述第一gRNA識別序列的第一雙鏈DNA和含有第二gRNA識別序列的第二雙鏈DNA；

步驟三：分別根據所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA設計gRNA表達載體，記為第一gRNA載體和第二gRNA載體，其中，所述第一gRNA載體中含有所述第一雙鏈DNA，所述第二gRNA載體中含有所述第二雙鏈DNA；

步驟四：將所述第一gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體轉染進微型豬胎兒成纖維細胞中，篩選出酪氨酸酶基因敲除的陽性克隆細胞；

步驟五：將所述陽性克隆細胞注入母豬的去核卵母細胞中，形成重構卵。

2.如權利要求1所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟一中，所述豬物種的酪氨酸酶基因的序列為NCBI數據庫中基因編號為407745所示的序列；所述第一外顯子的正鏈上滿足G(N)₁₉NGG序列模式的序列如SEQ?ID?No.1所示，所述第一外顯子的互補鏈上滿足G(N)₁₉NGG序列模式的序列如SEQ?ID?No.2所示；所述第一gRNA識別序列如SEQ?ID?No.3所示，所述第二gRNA識別序列如SEQ?ID?No.4所示。

3.如權利要求2所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟二具體包括如下步驟：

分別對所述第一gRNA識別序列和第二gRNA識別序列設計互補序列；

在所述第一gRNA識別序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ?ID?No.7所示的序列片段，并在所述第一gRNA識別序列的互補序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQID?No.8所示的序列片段，將加有粘性末端的第一gRNA識別序列及加有粘性末端的互補序列進行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA；

在所述第二gRNA識別序列的5’端加上CACC序列片段，形成如SEQ?ID?No.9所示的序列片段，并在所述第二gRNA識別序列的互補序列的5’端加上AAAC序列片段，形成如SEQID?No.10所示的序列片段，將加有粘性末端的第二gRNA識別序列及加有粘性末端的互補序列進行退火處理，得到帶有粘性末端的所述第二雙鏈DNA。

4.如權利要求3所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟三具體包括如下步驟：

在gRNA-GFP-T1質粒載體中引入兩個BbsI酶切位點，得到中間體質粒；

對所述中間體質粒使用限制性內切酶BbsI酶切，并將帶有粘性末端的所述第一雙鏈DNA和所述第二雙鏈DNA對應連接到酶切后的中間體質粒上，分別得到所述第一gRNA載體和所述第二gRNA載體。

5.如權利要求4所述的白化病模型豬的重構卵的構建方法，其特征在于，所述步驟四中，在將所述第一gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體轉染進微型豬胎兒成纖維細胞之前，還包括分別對所述第一gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體經轉化處理后擴大培養，再提取所述第一gRNA載體、所述第二gRNA載體及含有Cas9切口酶基因的表達載體的步驟。