[發(fā)明專利]銅綠假單胞菌疫苗及其制備方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410437862.0
• 申請(qǐng)日: 2014-08-29
• 公開（公告）號(hào): CN104189898B
• 公開（公告）日: 2017-09-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魏于全;李燕燕;王震玲
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K39/104
• 分類號(hào): A61K39/104;A61P31/04;C12N13/00
• 代理公司: 成都虹橋?qū)＠聞?wù)所(普通合伙)51124
• 代理人: 梁鑫

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明是涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種細(xì)菌疫苗及其制備方法。

技術(shù)背景

銅綠假單胞菌(P.aeruginosa)，又稱綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，其對(duì)外界各種環(huán)境及滅活措施抵抗力較強(qiáng)，尤其在潮濕的環(huán)境中可長(zhǎng)期生存。土壤、水、空氣、人和動(dòng)物的皮膚、粘膜、腸道及上呼吸道等多處都有該菌存在。其致病特點(diǎn)是引起繼發(fā)感染，多發(fā)生在機(jī)體抵抗力降低下的病人，如大面積燒傷，長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、腫瘤、低蛋白血癥患者等。銅綠假單胞菌引起的感染可發(fā)生在人體任何部位，臨床上常見的有皮膚和皮下組織感染，中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、尿道感染、敗血癥等。據(jù)近年的調(diào)查報(bào)告，院內(nèi)感染中30％以上都是由銅綠假單胞菌引起的。對(duì)于銅綠假單胞菌引起的感染主要靠藥物治療，而近些年抗生素的廣泛應(yīng)用產(chǎn)生了大量的耐藥菌株進(jìn)一步加劇了銅綠假單胞菌對(duì)患者的威脅。目前已經(jīng)研究成熟的銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的耐藥機(jī)制包括以下幾方面：①細(xì)菌外膜通透性降低，阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)膜靶位；②銅綠假單胞菌細(xì)胞通過主動(dòng)外排過程，可將范圍極其廣泛的結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗生素或其他有毒物質(zhì)排出細(xì)胞外；③改變抗生素的作用靶點(diǎn)青霉素結(jié)合蛋白(PBPs)的數(shù)量或結(jié)構(gòu)，以降低藥物與PBPs的親和力，從而產(chǎn)生固有耐藥；④質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的beta-內(nèi)酰胺酶使抗生素失活。所以目前銅綠假單胞菌的感染已經(jīng)到了無抗生素可用的階段，通過免疫方式預(yù)防及控制銅綠假單胞菌感染已是大勢(shì)所趨。

疫苗是一種能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，活化T和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性針對(duì)靶抗原(病毒、細(xì)菌等)的抗體或者免疫細(xì)胞的物質(zhì)。經(jīng)典的疫苗起源于抗感染免疫，即采用處理過的病原微生物，特別是細(xì)菌及其衍生物作為抗原，促使機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)以預(yù)防感染性疾病。目前全世界研究的銅綠假單胞菌疫苗制備方式已經(jīng)涉及多個(gè)技術(shù)層面，如熱或者甲醛處理的死菌疫苗，減毒疫苗，亞單位疫苗，單一組分(菌毛、鞭毛、外膜蛋白OprI/OprF等)疫苗等。在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，單一組分疫苗得了較好的預(yù)防效果，但由于抗原成分單一，只能針對(duì)單一的疾病(如肺炎等)的感染。滅活(熱、甲醛等)或者減毒(基因突變)的全菌體疫苗抗病譜相對(duì)擴(kuò)大，但由于制備過程某些未知抗原成分的滅活，細(xì)菌代謝活性降低，造成免疫原性及預(yù)防效果較差，且由于滅活不徹底，造成疫苗殘留毒性較大。關(guān)于全菌體疫苗的研發(fā)已經(jīng)在眾多種屬細(xì)菌(志賀菌，淋球菌，腦膜炎雙球菌等)中實(shí)施，但這些疫苗均已失敗而告終，可想而知制成有效的全菌體疫苗是非常困難的，而目前研制的銅綠假單胞菌疫苗也依舊存在較大的局限性。理想的銅綠假單胞菌疫苗是盡可能的包括所有潛在致病抗原成分，對(duì)機(jī)體無潛在威脅毒性，能夠針對(duì)不同血清型品種均有較好預(yù)防效果的低毒性全菌體疫苗。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的全菌體疫苗保護(hù)效力低，對(duì)機(jī)體的毒性大，難以治愈感染而不能滿足臨床免疫需求的問題，提供的一種新的銅綠假單胞菌全菌體疫苗及其制備方法。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種銅綠假單胞菌疫苗的制備方法。該方法包括以下步驟；首先獲取銅綠假單胞菌菌體；然后射線輻照細(xì)菌得到銅綠假單胞菌細(xì)菌疫苗。

其中，上述方法中所獲取的細(xì)菌菌體是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌體。

進(jìn)一步的，上述方法包括以下步驟：

(1).獲取用于制備疫苗的銅綠假單胞菌細(xì)菌株；

(2).增殖細(xì)菌：將步驟(1)獲取的細(xì)菌株接種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；

(3).收集菌體：收集步驟(2)得到的含有菌體及基質(zhì)成分的培養(yǎng)基，離心并收集離心沉淀物；

(4).射線處理：將上述凈化處理的離心沉淀物重懸成細(xì)菌懸液，移至非金屬容器中，用射線輻照細(xì)菌懸液；

(5).調(diào)節(jié)菌體濃度：將步驟(4)得到的射線輻照后的細(xì)菌懸液再次重懸，調(diào)節(jié)為最終使用目標(biāo)細(xì)菌濃度，即得到銅綠假單胞菌疫苗

優(yōu)選的，上述方法在第(4)步射線處理前或者后，還進(jìn)行純化菌體的步驟。純化菌體是為了去除有培養(yǎng)基及相應(yīng)細(xì)菌胞外分泌物。純化步驟可以使用各種不引起機(jī)體過敏反應(yīng)的溶劑進(jìn)行洗滌。優(yōu)選方案為無菌生理鹽水或者PBS洗滌。集菌純化步驟也以使用如濃縮、過柱收集法等本領(lǐng)域常用方法。

其中，上述方法中所述的射線輻照為使細(xì)菌失去增殖活性且代謝活性保留。