[發(fā)明專利]一種新型核糖核酸酶A及其純化生產(chǎn)工藝

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410437404.7
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN104212779A
• 公開（公告）日: 2014-12-17
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉艷杰;陳銘璐;董穎紅
• 申請（專利權(quán)）人: 寧波美成生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/22
• 分類號: C12N9/22;C12N15/55
• 代理公司: 寧波市鄞州甬致專利代理事務(wù)所(普通合伙) 33228
• 代理人: 李迎春

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新型核糖核酸酶A，以及該新型核糖核酸酶A的純化生產(chǎn)工藝。

背景技術(shù)

核糖核酸酶A(RNase?A)是內(nèi)切核糖核酸酶，可特異地攻擊RNA上嘧啶殘基的3'端，切割與相鄰核苷酸形成的磷酸二酯鍵。核糖核酸酶A是脊椎動物所特有的蛋白質(zhì)家族，除了水解RNA以外，它們還參與細(xì)胞成熟、細(xì)胞凋亡、血管生成以及宿主防御等過程，在疾病的診斷和治療方面表現(xiàn)出重要的應(yīng)用價值。

RNase?A家族成員具有很高的序列相似性，它們大多含有6-8個半胱氨酸并形成分子內(nèi)二硫鍵，以維持特有的空間結(jié)構(gòu)。RNase?A基因結(jié)構(gòu)中不含有內(nèi)含子，成熟的RNase?A的氨基酸序列中均含有非常保守的CKXXNTF氨基酸序列(XX為任意氨基酸)。

核糖核酸酶A最早是在牛的胰腺中發(fā)現(xiàn)的，牛胰腺核糖核酸酶A包括一個374bp的開放閱讀框，編碼124個氨基酸的多肽鏈(如SEQ?ID?NO：4所示)，預(yù)測其等電點為8.30，分子量為14kD。

牛胰腺核糖核酸酶A是第一個被應(yīng)用于動物腫瘤和白血病臨床治療的RNase?A，并取得一定的效果。目前所用的RNase?A多從牛胰腺中提取，雖然原料來源豐富，但純化的技術(shù)要求較高，而且有DNA酶和病毒(如牛海綿狀腦病病毒)污染危險，因此，WHO和FDA等國際權(quán)威機(jī)構(gòu)明確規(guī)定動物源性的牛核糖核酸酶A不能用于制備人和動物基因治療或基因免疫用途的重組質(zhì)粒。

張泉等發(fā)表的論文“牛胰腺核糖核酸酶A的基因克隆、表達(dá)及初步鑒定”中提出利用RT-PCR從牛胰腺總RNA中擴(kuò)增出大小和序列正確的RNase?A?cDNA，并在大腸桿菌中獲得分泌性表達(dá)重組酶，為生物制品級核算疫苗或基因治療用途質(zhì)粒DNA的制備提供了借鑒。但是，使用該方法誘導(dǎo)表達(dá)的重組核糖核酸酶A蛋白表達(dá)量不高，且純化困難。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種新型核糖核酸酶A，以及該新型核糖核酸酶A的純化生產(chǎn)工藝。

本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：

一種新型核糖核酸酶A，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

編碼上述新型核糖核酸酶A的基因，其堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示。

上述新型核糖核酸酶A的純化生產(chǎn)工藝，它包括以下步驟：

S1：對SEQ?ID?NO：2所示的基因序列進(jìn)行全基因合成，得到新型核糖核酸酶A基因；

S2：將新型核糖核酸酶A基因連接到PPIC9K載體上，構(gòu)建PPIC9K重組質(zhì)粒；

S3：將PPIC9K重組質(zhì)粒線性化，然后電轉(zhuǎn)化到畢赤酵母GS115中；

S4：篩選重組子，獲得畢赤酵母重組質(zhì)粒；

S5：將畢赤酵母重組質(zhì)粒接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，30℃、280rpm震蕩培養(yǎng)12-24h，獲得一級種子液；

S6：將一級種子液按10％的體積比接種到Y(jié)PD液體培養(yǎng)基，30℃、220rpm震蕩16-24h，獲得二級種子液；

S7：將二級種子液按5％的體積比接種到含發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，設(shè)定攪拌轉(zhuǎn)速為300rmp、通氣量為30％、溫度30℃，開始發(fā)酵培養(yǎng)，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量、罐壓使DO維持在20％～35％，當(dāng)DO陡然上升至95-100％時，說明培養(yǎng)基中甘油已經(jīng)消耗殆盡，立即進(jìn)入下一步驟；

S8：以12ml/h/L的速率流加50％甘油(甘油與去離子水按體積比1︰1配比而成)到發(fā)酵罐中，維持4h，同時提高攪拌速度、通氣量、罐壓使DO維持在20％～35％，停止補(bǔ)加甘油后，觀察DO值上升至100％后，繼續(xù)維持“甘油饑餓”狀態(tài)1h；

S9：以1ml/h/L的低速流加甲醇(100％甲醇)4h，以使工程菌適應(yīng)以甲醇為唯一碳源的環(huán)境，再以每半小時增加10％的流速增到3ml/h/L至誘導(dǎo)結(jié)束，通過調(diào)節(jié)攪拌速度、通氣量、罐壓和甲醇流加速率使DO值維持在20％～35％，每4h取樣一次，測定發(fā)酵液中酵母菌體細(xì)胞光密度OD₆₀₀，當(dāng)OD₆₀₀為400時結(jié)束誘導(dǎo)；

S10：純化目的新型核糖核酸酶A，得到目的新型核糖核酸酶A融合蛋白。