[發明專利]用于腫瘤免疫治療的多系活化殺傷細胞的制備方法

在審

• 申請號: 201410436844.0
• 申請日: 2014-09-01
• 公開（公告）號: CN104232578A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 蘇曉三;汪珺;王翼寅;陳睿;楊柳;張蕾
• 申請（專利權）人: 昆明市第一人民醫院
• 主分類號: C12N5/0786
• 分類號: C12N5/0786;A61P35/00
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及一種人類腫瘤疾病的治療方法，特別是一種專用于腫瘤免疫治療的多系活化殺傷（Polylineage?activated?killer，PAK）細胞的制備方法。

背景技術

體內回輸免疫活性細胞的過繼細胞治療（Adoptive?cell?therapy，ACT）與傳統的腫瘤治療方法相比，可以在不損傷機體免疫系統結構和功能的前提下，直接殺傷腫瘤細胞；同時調節和增強機體的免疫功能，因而成為腫瘤手術、放療和化療的重要輔助治療方法，為預防腫瘤復發、轉移，改善晚期腫瘤患者的生存質量提供了新的途徑。ACT已在惡性黑色素瘤、腎癌、淋巴瘤等腫瘤治療中取得了一定療效。

人外周血單個核細胞（Peripheral?blood?mononuclear?cell，PBMC）中含有多種具有殺傷腫瘤細胞活性的免疫效應細胞，如TCRgd⁺?T細胞、CD3^—CD56⁺?NK細胞、CD3⁺CD56⁺?NKT細胞及CD3⁺CD8⁺?T細胞等。這些效應細胞具有不同的識別、殺傷腫瘤細胞的特性。

1、自然殺傷（Nature?killer，NK）細胞無需抗原預先致敏即可直接殺傷靶細胞，且不具有“主要組織相容性復合物（Major?histocompatibility?complex，MHC）限制性”，而腫瘤細胞往往缺乏MHC?I類分子的有效表達，因此，NK細胞在抗腫瘤免疫中具有重要的作用。

2、自然殺傷樣T（Natural?killer?T，NKT）細胞是免疫細胞中一個具有特定標志的T細胞亞群。NKT細胞表面既表達T細胞表面標志，如CD3、TCR，又表達NK細胞的表面標志，如CD56、CD122等。NKT細胞只能識別由CD1d分子遞呈的特異性糖脂類分子，而不能識別由MHC分子遞呈的抗原肽，比如α-半乳糖神經酰胺（α-galactosylceramide,?α-GalCer）能以CD1d限制的和TCR介導的方式激活NKT細胞。經活化的NKT細胞既可直接作為抗腫瘤效應細胞發揮殺傷作用，又能通過激活其他免疫效應細胞，如NK細胞，間接實現抗腫瘤作用。

3、在人類的外周血中，大多數的T細胞表達αβ型的T細胞受體(T?cell?receptor，TCR)。表達有γδ型TCR的T細胞僅占外周血中CD3⁺?T細胞的5%~10%，并且在脾和淋巴結中的分布很少，而是大量地分布于粘膜相關淋巴組織（Mucosal?associated?lymphocytes?tissue，MALT），如腸、皮膚、食管、氣管、肺和生殖道上皮，是上皮內淋巴細胞（Intraepithelial?lymphocyte，IEL）的主要成分之一。研究表明甲羥戊酸代謝產物如異戊烯焦磷酸（IPP）可直接作用于gdTCR，進而促使gdT細胞活化、增殖?；罨膅dT細胞識別上皮來源腫瘤細胞表達的非經典MHC-I類分子MICA/MICB，這是一種不需要抗原提呈的MHC分子非依賴的途徑。因此，gdT細胞可能對識別和殺傷那些逃避了αβT細胞的腫瘤細胞提供了一個選擇和彌補的方式。

4、體外擴增培養的CD8⁺?T細胞表面NKG2D的表達明顯上調，通過抗體封鎖、間接的細胞溶解分析以及siRNA研究證實純化的CD8⁺?T細胞抗腫瘤細胞的細胞毒作用是通過NKG2D介導的識別和信號傳導，而不是通過TCR。小鼠CD8⁺CD44^high?T細胞表達低水平的NKG2D受體，經IL-2激活后表達高水平的NK細胞受體NKG2D及2B4，并對表達NKG2D配體Rae-1的同基因腫瘤細胞具有極大的殺傷效應。

目前ACT多采用一種或幾種效應細胞刺激劑制備免疫效應細胞，獲得的免疫效應細胞的殺傷活性通常來自某一個具有特定表型的細胞群，如CIK中的CD3⁺CD56⁺?NKT細胞。腫瘤的一個非常重要的特性是其“異質性”，因此，僅采用一種具有特定表型的效應細胞難以徹底清除腫瘤細胞，其療效及適用性較差。

發明內容