[發明專利]一種新型的IgM－IgG聚合物及其聚合方法

有效

• 申請號: 201410431339.7
• 申請日: 2014-08-28
• 公開（公告）號: CN104193825B
• 公開（公告）日: 2017-02-15
• 發明（設計）人: 王智聯;李松羊;廖起牧
• 申請（專利權）人: 上海昶達生物科技有限公司
• 主分類號: C07K16/46
• 分類號: C07K16/46
• 代理公司: 蘇州創元專利商標事務所有限公司32103
• 代理人: 馬明渡

1.一種新型的IgM－IgG聚合物，其特征在于：所述IgM－IgG聚合物符合結構式（1）所示，

?????????????????????????????????????????????????????????（1）；

或結構式（2）所示，

?????????（2）；

式中，n＝1~5。

2.一種新型的IgM－IgG聚合物的聚合方法，其特征在于：依次由下列步驟組成：

第一部分，IgM與S-乙酰硫代乙酸琥珀酰亞胺酯的交聯

第一步，將IgM免疫球蛋白溶于PBS混合緩沖液中得到濃度為1mg/ml的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后裝入透析袋中，在2~8℃條件下，在所述PBS混合緩沖液中透析8~15小時；其中，所述PBS混合緩沖液為10mmol/L并且pH為7.4的磷酸鹽緩沖液與0.15mol/L氯化鈉的混合溶液；

第二步，移出第一步中透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液，然后向透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液中緩緩加入新鮮配制的濃度為10~50mmol/L?S-乙酰硫代乙酸琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液，震蕩混勻，15~35℃下反應25~35分鐘得反應液；反應結束后，將反應液裝入透析袋中，在2~8℃條件下，在所述PBS混合緩沖液中透析8~15小時；其中，所述透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液中的IgM免疫球蛋白與所述S-乙酰硫代乙酸琥珀酰亞胺酯的摩爾比為1:10~1:30；所述透析后的IgM免疫球蛋白緩沖液中的IgM免疫球蛋白與所述濃度為10~50mmol/L?S-乙酰硫代乙酸琥珀酰亞胺酯的二甲基亞砜溶液中的S-乙酰硫代乙酸琥珀酰亞胺酯反應生成的產物為IgM-SATA，其結構如式（3）所示，得到IgM免疫球蛋白初聚液，

?????????????（3）；

第三步，向第二步得到的IgM免疫球蛋白初聚液中緩緩加入新鮮配制的羥胺溶液，混勻后，15~35℃下反應1.5~2.5小時，其中，所述羥胺溶液是指含有0.5mol/L羥胺、25mmol/L乙二胺四乙酸、10mmol/L且pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液以及0.15mol/L氯化鈉的混合溶液；反應結束后，將反應液裝入透析袋中，在2~8℃條件下，在所述PBS混合緩沖液中透析8~15小時，得到IgM免疫球蛋白中聚液；其中，所述IgM免疫球蛋白初聚液與所述羥胺溶液的反應體積比為10:1；所述IgM免疫球蛋白初聚液與所述羥胺溶液中的羥胺發生脫酰基反應，生成的產物為IgM-SH，其結構如式（4）所示，

??????????（4）；

第二部分，IgG與4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯的交聯

第一步，將IgG免疫球蛋白溶于所述PBS混合緩沖液中得到濃度為1mg/ml的IgG免疫球蛋白緩沖液，然后裝入透析袋中，在2~8℃條件下，在所述PBS混合緩沖液中透析8~15小時；

第二步，移出第一步中透析后的IgG免疫球蛋白緩沖液，然后在透析后的IgG免疫球蛋白緩沖液中緩緩加入新鮮配制的濃度為1.5mg/ml?4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯的PBS溶液，震蕩混勻，15~35℃下反應25~35分鐘得反應液；反應結束后，將反應液裝入透析袋中，在2~8℃條件下，在所述PBS混合緩沖液中透析8~15小時，得到IgG免疫球蛋白初聚液；其中，所述透析后的IgG免疫球蛋白緩沖液中的IgG免疫球蛋白與所述4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯的PBS溶液中的4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯之間的摩爾比為1:20；

所述透析后的IgG免疫球蛋白緩沖液中的IgG免疫球蛋白與所述4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯的PBS溶液中的4-(N-馬來酰亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯反應生成的產物為馬來酰亞胺激活的IgG，其結構如式（5）所示，

??????????（5）；?

第三部分，IgM免疫球蛋白中聚液與IgG免疫球蛋白初聚液的交聯

第一步，將所述IgM免疫球蛋白中聚液與所述IgG免疫球蛋白初聚液裝入透析袋中并混勻，在2~8℃條件下，反應1.5~2.5小時；然后于所述PBS混合緩沖液中透析8～15小時，得到IgM－IgG免疫球蛋白聚合物原液；其中，所述IgM免疫球蛋白中聚液中的IgM免疫球蛋白和所述IgG免疫球蛋白初聚液中的IgG免疫球蛋白的摩爾比為1:1~5，所述IgM免疫球蛋白中聚液中的IgM免疫球蛋白與所述IgG免疫球蛋白初聚液中的IgG免疫球蛋白反應，生成的產物為IgM-馬來酰亞胺-IgG，其結構如式（6）所示，

??????????（6）；

第二步，將得到的所述IgM－IgG免疫球蛋白聚合物原液過葡聚糖凝膠G200柱，再以所述PBS混合緩沖液洗脫，流速為0.25ml/分鐘，分管收集洗脫后的溶液，并測OD280nm吸光值，將測得的第一峰的各管溶液混合，再將混合后的溶液濃縮至約2mg/ml，此即為純化的IgM－IgG聚合物終產物。