[發明專利]一種香石竹PS1基因ihpRNA載體的構建方法

在審

• 申請號: 201410431244.5
• 申請日: 2014-08-29
• 公開（公告）號: CN104195142A
• 公開（公告）日: 2014-12-10
• 發明（設計）人: 周旭紅;莫錫君;馬璐琳;蘇艷;施自明;蔣亞蓮;桂敏;田敏
• 申請（專利權）人: 云南省農業科學院花卉研究所
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;C12N15/66;A01H5/00
• 代理公司: 昆明合眾智信知識產權事務所 53113
• 代理人: 康珉

1.一個與香石竹(Dianthus?caryophyllusL.)減數分裂相關PS1基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.一種香石竹PS1基因ihpRNA載體的構建方法，包括以下步驟：

(1)香石竹PS1基因正義和內含子片段的克隆及連接、測序和轉化

以香石竹總DNA為模版，用PS1RNAI-2259F和PS1RNAI-2259-579introR引物對進行PCR擴增，得到香石竹PS1基因正義和內含子片段PCR產物，該PCR產物經瓊脂糖凝膠純化后，連接克隆載體pMD18-T，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，重組子經PCR鑒定后測序，得到目的正義內含子片段重組子，命名為pMD-F-INTRO，正義和內含子片段的序列如SEQ?ID?NO：2所示；所述PS1RNAI-2259F引物的堿基序列如SEQ?ID?NO：6所示，PS1RNAI-2259-579introR引物的堿基序列如SEQ?ID?NO：7所示；

(2)香石竹PS1基因反義片斷的克隆及連接、測序和轉化

以香石竹總DNA為模版，用PS1RNAI-INVERSE-F和PS1RNAI-INVERSE-R引物對進行PCR擴增，得到香石竹PS1基因反義片斷PCR產物，該PCR產物經瓊脂糖凝膠純化后，連接克隆載體pMD18-T，連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，重組子經PCR鑒定后測序，得到目的反義片斷重組子，命名為pMD-R，反義片斷的序列如SEQ?ID?NO：3所示；所述PS1RNAI-INVERSE-F引物的堿基序列如SEQ?ID?NO：8所示，PS1RNAI-INVERSE-R引物的堿基序列如SEQ?ID?NO：9所示；

(3)表達載體pCAMBIA1301-220.6的構建

Hind?III/EcoR?I雙酶切pCAMBIA1301，Hind?III/EcoR?I雙酶切pBI220.6，回收pCAMBIA1301的大片段和pBI220.6的小片段，T4DNA連接酶連接，連接產物轉化DH5α感受態細胞，提取質粒，進行雙酶切驗證，得到改造好的表達載體pCAMBIA1301-220.6；

(4)重組載體的雙酶切和回收

提取含有pMD-F-INTRO重組子質粒和pMD-R重組子質粒，pMD-F-INTRO重組子質粒用BamH?Ⅰ/Kpn?Ⅰ雙酶切，回收香石竹PS1基因正義和內含子片段，pMD-R重組子質粒用Kpn?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切，回收香石竹PS1基因反義片斷，表達載體pCAMBIA1301-220.6用BamH?Ⅰ/Sac?Ⅰ雙酶切，回收pCAMBIA1301-220.6片段；

(5)回收片段的連接

將步驟(4)回收的香石竹PS1基因正義和內含子片段、香石竹PS1基因反義片段和pCAMBIA1301-220.6片段用T4DNA連接酶連接即得香石竹PS1基因ihpRNA載體。

3.根據權利要求2香石竹PS1基因ihpRNA載體的構建方法，其特征在于：步驟(5)所述的載體構建方法為正義和內含子片斷及反義片斷同時連接到表達載體pCAMBIA1301-220.6中，pCAMBIA1301-220.6表達載體：香石竹PS1基因正義和內含子片斷：香石竹PS1基因反義片斷的摩爾比為1：3：3～3：1：1。

4.一種香石竹PS1基因ihpRNA載體，其特征在于：ihpRNA載體含有香石竹PS1基因的正義和內含子片段及反義片斷；所述的香石竹PS1基因的正義和內含子片段的堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述的香石竹PS1基因的反義片斷的堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示。

5.根據權利要求2所述的一種香石竹PS1基因ihpRNA表達載體的構建方法，其特征在于所述的內含子片斷為PS1基因本身的內含子。

6.權利要求4所述香石竹PS1基因ihpRNA載體在提高香石竹2n配子頻率方面的應用。