[發(fā)明專利]紅系祖細胞凍存液及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410429678.1
• 申請日: 2014-08-27
• 公開（公告）號: CN104222069A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳琳;裴雪濤;習佳飛;謝小燕;周軍年;李艷華;岳文;房芳;南雪;劉大慶
• 申請（專利權(quán)）人: 中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院野戰(zhàn)輸血研究所
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 北京清亦華知識產(chǎn)權(quán)代理事務所(普通合伙) 11201
• 代理人: 李志東

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及細胞凍存領(lǐng)域，特別是干細胞凍存領(lǐng)域。具體地，涉及紅系祖細胞凍存領(lǐng)域。更具體地，涉及紅系祖細胞凍存液、用于凍存紅系祖細胞的試劑盒以及凍存紅系祖細胞的方法。

背景技術(shù)

近年來由于血液來源緊張以及輸血相關(guān)疾病的發(fā)生使人們期望尋找更為安全、充足的血液來源。研究表明干細胞在體外能夠誘導分化為紅細胞可作為新的血液來源。除了成熟紅細胞外，紅系祖細胞也可以替代臨床紅細胞輸注，發(fā)揮其造血支持治療作用，而且紅系祖細胞能夠在體內(nèi)繼續(xù)增殖，對于很多需要反復輸血治療的患者，有望減少輸血次數(shù)以及輸血產(chǎn)生的副作用，從而，紅系祖細胞為臨床血液供應提供新的替代途徑。

目前臨床用的紅細胞產(chǎn)品體外保存時間較短，而紅系祖細胞作為有核細胞可以在體外進行長期凍存，如果能夠?qū)w外誘導分化的紅系祖細胞長期的保存，并在復蘇后保持其祖細胞特性，將更有利于臨床輸血應用。但是對于紅系祖細胞這一特定的細胞類型尚缺乏凍存方面相關(guān)研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在至少解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個目的在于提出一種用于紅系祖細胞長期保存，并能夠在復蘇后保持其祖細胞特性的凍存液。

需要說明的是，本發(fā)明是基于發(fā)明人的下列發(fā)現(xiàn)而完成的：

DMSO是常用的細胞冷凍保存劑，單獨使用保存紅系祖細胞存活率僅為(51.20±10.13)％。因而，發(fā)明人致力于尋找能夠促進冷凍保存下紅系祖細胞存活率的成分，以便與DMSO聯(lián)用，以便通過其與DMSO協(xié)同作用，達到能夠長期保存紅系祖細胞的效果。例如，發(fā)明人利用DMSO(二甲基亞砜，Dimethyl?sulfoxide)協(xié)同海藻糖對體外誘導10d的臍帶血紅系祖細胞進行冷凍保存，發(fā)現(xiàn)細胞存活率由凍存前的(93.27±1.79)％降至(48.37±9.14)％，冷凍保存作用并不理想。然而，人血清白蛋白在冷凍復蘇過程中能夠調(diào)節(jié)滲透壓，而血漿中又含有多種營養(yǎng)成分，因而，發(fā)明人嘗試將血漿和HSA(人血清白蛋白，Human?Serum?Albumin)與DMSO結(jié)合，制備紅系祖細胞的凍存液，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這種凍存液對凍存細胞有較好的保護作用，凍存細胞復蘇后增殖能力強，細胞回收率高。

因而，根據(jù)本發(fā)明的一個方面，本發(fā)明提供了一種紅系祖細胞凍存液。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該凍存液包含DMSO；HSA；以及血漿。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該凍存液能夠有效用于凍存紅系祖細胞，細胞復蘇后增殖能力強，細胞回收率高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述DMSO的濃度為2體積％-10體積％，優(yōu)選10體積％。由此，對紅系祖細胞的凍存效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述HSA的濃度為2體積％-5體積％。由此，有利于在冷凍復蘇過程中調(diào)節(jié)滲透壓，對細胞保護作用好，并且凍存液成本低。根據(jù)本發(fā)明的一些具體示例，所述HSA的濃度為2體積％。由此，冷凍復蘇過程中滲透壓調(diào)節(jié)效果好，從而能夠有效保護細胞，提高細胞存活率，并且保證凍存液成本。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述血漿的濃度為20體積％-88體積％。由此，有利于凍存細胞的保護，細胞復蘇后增殖能力好。根據(jù)本發(fā)明具體示例，所述血漿的濃度為60體積％。由此，對細胞的保護作用突出，細胞復蘇后增殖能力強。根據(jù)本發(fā)明的實施例，所述血漿為自體血漿。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，當所述DMSO、HSA和血漿的體積百分數(shù)之和小于1時，所述紅系祖細胞凍存液進一步包含剩余體積的IMDM或Stemspan培養(yǎng)基。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明還提供了一種用于凍存紅系祖細胞的試劑盒，其包含前面所述的紅系祖細胞凍存液。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該試劑盒能夠有效用于凍存紅系祖細胞，且細胞有效保存時間長，復蘇后細胞增殖能力強，細胞回收率高。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明還提供了一種凍存紅系祖細胞的方法。根據(jù)本發(fā)明的實施例，該方法利用前面所述的紅系祖細胞凍存液或者試劑盒，凍存所述紅系祖細胞。發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，采用該方法凍存紅系祖細胞，細胞有效保存時間長，復蘇后細胞增殖能力強，細胞回收率高。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，每10⁵-10⁷個紅系祖細胞采用1ml所述紅系祖細胞凍存液。由此，能夠有效實現(xiàn)紅系祖細胞的凍存。根據(jù)本發(fā)明的具體示例，每10⁶個紅系祖細胞采用1ml所述紅系祖細胞凍存液。由此，細胞凍存效果好。

根據(jù)本發(fā)明的實施例，于液氮中進行所述凍存。由此，有利于細胞長期保持，對細胞的保護作用好。