[發(fā)明專利]抗草甘膦紫花苜蓿植株的篩選方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201410429650.8 | 申請(qǐng)日： | 2014-08-28 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN104255403A | 公開(kāi)（公告）日： | 2015-01-07 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 張吉宇;吳凡;段珍;狄紅艷;霍雅馨;張代玉 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 蘭州大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | A01G31/00 | 分類號(hào)： | A01G31/00;A01H1/04;A01H1/06 |
| 代理公司： | 蘭州振華專利代理有限責(zé)任公司 62102 | 代理人： | 張真 |
| 地址： | 730000 *** | 國(guó)省代碼： | 甘肅;62 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 抗草甘膦 紫花苜蓿 植株 篩選 方法 | ||
1.一種抗草甘膦紫花苜蓿植株的培養(yǎng)基篩選方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)MS培養(yǎng)基萌發(fā)種子
精選紫花苜蓿種子；配制MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無(wú)菌條件下進(jìn)行種子消毒：60-100％酒精浸洗種子2-0.5min；2％次氯酸鈉溶液浸洗5-15min；ddH2O清洗種子3-10次；鋪板，用鑷子將消過(guò)毒的種子均勻鋪于MS培養(yǎng)基上，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，22-18℃，0-18h光照，6-24h黑暗發(fā)芽；胚根突破種皮視為萌發(fā)，第3-6天，平均發(fā)芽率達(dá)到50％以上，待用；
(2)劑量篩選
草甘膦設(shè)置多個(gè)處理，濃度分別為0mg/L至800mg/L，配置以上不同濃度的草甘膦培養(yǎng)基，每個(gè)濃度多個(gè)重復(fù)，設(shè)與濃度相匹配的多個(gè)培養(yǎng)板；
無(wú)菌條件下，將MS培養(yǎng)基中發(fā)芽的健康種子轉(zhuǎn)入不同濃度草甘膦培養(yǎng)基，封口膜封口后置于18-22℃人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18天，18天后統(tǒng)計(jì)致死率，篩選出用于培養(yǎng)基篩選的草甘膦致死劑量為600mg/L；
(3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
紫花苜蓿種子用98％濃硫酸處理3-10min先打破硬實(shí)，蒸餾水沖洗3-10次；種子在100mM，pH7.0的磷酸緩沖液中，于4℃下預(yù)浸種6-18h，用磷酸緩沖液配置濃度為0.2-2.0％(v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室溫黑暗條件下用甲基磺酸乙酯處理種子，處理時(shí)長(zhǎng)12-24h，置于低溫?fù)u床，120rpm/min，18-22℃不斷搖晃，再用自來(lái)水沖洗2-5h以去除殘留的甲基磺酸乙酯，每25-35min放置10-20min；之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心管中；配制MS基本培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；在MS培養(yǎng)基萌發(fā)誘變后的種子，封口膜封口后置于人工培養(yǎng)箱，22-18℃，0-18h光照，24-6h黑暗發(fā)芽；
(4)抗草甘膦紫花苜蓿植株篩選
配置添加了致死劑量600mg/L草甘膦的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)板備用；無(wú)菌條件下，將步驟(3)中MS培養(yǎng)基萌發(fā)第3-6天的健康種子轉(zhuǎn)入添加了致死劑量的草甘膦培養(yǎng)基中，封口膜封口后置于22-18℃人工培養(yǎng)箱培養(yǎng)，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10-20d，每天觀察統(tǒng)計(jì)，10-20d后篩選出抗性植株；
配置1/2MS培養(yǎng)基，將篩選出的存活植株轉(zhuǎn)入1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，每2-3天更換一次1/2MS培養(yǎng)基，待存活株長(zhǎng)出復(fù)葉移栽到花盆繼續(xù)生長(zhǎng)；
(5)抗性植株再次篩選
將1/2MS培養(yǎng)基中長(zhǎng)出一片復(fù)葉的幼苗移栽至土壤繼續(xù)培養(yǎng)，待幼苗長(zhǎng)至2-3葉期開(kāi)始用600mg/L的草甘膦溶液進(jìn)行噴施，每隔4-8d噴一次，噴施2次。
2.一種抗草甘膦紫花苜蓿植株的土壤篩選方法，其特征在于包括如下步驟：
(1)土壤萌發(fā)種子
將挑選出的健康飽滿的紫花苜蓿種子播種于花盆，盆栽土壤為草炭土與蛭石1:1比例混合，pH為8.7，植物生長(zhǎng)室培養(yǎng)，25-15℃，14-18h光照，10-6h黑暗；每盆均勻撒播種子，覆土厚度約0.5-2cm，澆水200-500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長(zhǎng)2-5天，出苗后揭掉保鮮膜；
(2)劑量篩選
草甘膦設(shè)置多個(gè)處理，濃度分別為0mg/L至1600mg/L，配置不同濃度的草甘膦溶液裝于噴壺；每個(gè)濃度多個(gè)重復(fù)；
待幼苗長(zhǎng)至第一復(fù)葉期，在生長(zhǎng)至第14-16天時(shí)，開(kāi)始噴施除草劑；每隔4-8天噴施1次，連續(xù)12-24d，噴施3次；噴施除草劑時(shí)一來(lái)一回掃過(guò)葉面算作一次，保證除草劑均勻撒施到葉面上，第3次噴施后的第7天統(tǒng)計(jì)致死率，篩選出用于土壤篩選的草甘膦致死劑量為600mg/L；
(3)甲基磺酸乙酯半致死劑量誘變紫花苜蓿種子
紫花苜蓿種子用98％濃硫酸處理3-10min先打破硬實(shí)，蒸餾水沖洗3-10次；種子在100mM，pH7.0的磷酸緩沖液中，于4℃下預(yù)浸種6-18h，用磷酸緩沖液配置濃度為0.2-2.0％(v/v)的甲基磺酸乙酯溶液，在室溫黑暗條件下用甲基磺酸乙酯處理種子，處理時(shí)長(zhǎng)12-24h，置于低溫?fù)u床，120rpm/min，18-22℃不斷搖晃，再用自來(lái)水沖洗2-5h以去除殘留的甲基磺酸乙酯，每25-35min放置10-20min；之后鋪于干凈的濾紙上將種子晾干待用；挑選誘變后飽滿完好的種子，分裝于離心管中；將誘變后的紫花苜蓿種子均勻播種于土壤表面，覆土厚度約0.5-2cm，澆水200-500mL后用保鮮膜覆蓋，保鮮膜覆蓋生長(zhǎng)2-5天，出苗后揭掉保鮮膜；
(4)抗草甘膦紫花苜蓿植株篩選
待幼苗長(zhǎng)至第一復(fù)葉期，剔除生長(zhǎng)不一致的植株，用篩選出的草甘膦致死劑量開(kāi)始噴施，每隔4-8天噴施1次，連續(xù)12-24d，噴施3次；噴施草甘膦時(shí)一來(lái)一回掃過(guò)葉面算作一次，保證草甘膦均勻撒施到葉面上；3次噴施結(jié)束后的一周左右選取存活植株保活待用；
(5)抗性植株再次篩選
篩選出的可能具有草甘膦抗性的植株通過(guò)再次噴施草甘膦進(jìn)行鑒定；盆中存活單株繼續(xù)在土壤中生長(zhǎng)，待幼苗長(zhǎng)至2-3葉期開(kāi)始用600mg/L的草甘膦溶液進(jìn)行噴施，噴施草甘膦時(shí)一來(lái)一回掃過(guò)葉面算作一次；每隔4-8天噴一次，噴施2次。
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