[發明專利]多點突變單管快速檢測方法及試劑盒

有效

• 申請號: 201410429506.4
• 申請日: 2014-08-28
• 公開（公告）號: CN104293913B
• 公開（公告）日: 2016-11-30
• 發明（設計）人: 陳華云;陳嘉昌;肖湘文;丁渭;劉淑園;湯鏈;張天海
• 申請（專利權）人: 廣州和實生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 廣州嘉權專利商標事務所有限公司 44205
• 代理人: 鄭瑩

1.多點突變單管快速檢測方法，包括如下步驟：

1)設計針對不同點突變的ARMS引物及對應的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針；其中，中介連接引物由通用序列部分和特異序列部分構成，通用序列部分與通用熒光探針部分序列互補，特異序列部分與點突變下游的部分序列互補；

2)將ARMS引物及對應的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針與熱啟動快速Taq酶系統混合，擴增；

檢測反應體系的熒光變化，確定是否存在點突變。

2.根據權利要求1所述的多點突變單管快速檢測方法，其特征在于：通用熒光探針上連接熒光基團的核苷酸和淬滅探針上連接淬滅基團的核苷酸在互補配對后的間距不超過4個核苷酸。

3.根據權利要求1或2所述的多點突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引物中與突變位點下游的部分序列互補的核酸數量不少于5?bp。

4.根據權利要求3所述的多點突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引物中與突變位點下游的部分序列互補的核酸數量為15～30bp。

5.根據權利要求1、2或4所述的多點突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引物中與通用熒光探針部分核酸互補配對的核酸數量不少于5?bp。

6.根據權利要求5所述的多點突變單管快速檢測方法，其特征在于：中介連接引物中與通用熒光探針部分核酸互補配對的核酸數量為15～45bp。

7.根據權利要求1、2、4或6所述的多點突變單管快速檢測方法，其特征在于：通用熒光探針的一端連接有保護核酸序列。

8.一種EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒，包括DNA提取液，熱啟動快速Taq酶系統和EGFR突變檢測引物，其特征在于：所述EGFR突變檢測引物由多組ARMS引物及對應的下游引物、中介連接引物、通用熒光探針及其淬滅探針組成；其中：

中介連接引物的一端序列與待EGFR突變位點下游的部分序列互補，另一端序列與通用熒光探針部分核酸互補配對。

9.根據權利要求8所述的EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：ARMS引物的序列如下：?

ARMS引物1：TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGA

ARMS引物2：TTCAAAAAGATCAAAGTGCTGT

ARMS引物3：CAAAAAGATCAAAGTGCTGGC

ARMS引物4：TTCCCGTCGCTATCAAAACATC

ARMS引物5：TTCCCGTCGCTATCAAAACATC

ARMS引物6：TTCCCGTCGCTATCAAAACATC

ARMS引物7：TCCCGTCGCTATCAAGTCT

ARMS引物8：CCGTCGCTATCAAGGTACA

ARMS引物9：CGTCGCTATCAAGGCATCTC

ARMS引物10：TCCCGTCGCTATCAAGTCT

ARMS引物11：CCGTCGCTATCAAGGAGC

ARMS引物12：CCGTCGCTATCAAGGAGC

ARMS引物13：CCGTCGCTATCAAGGATCC

ARMS引物14：CCGTCGCTATCAAGGAAGC

ARMS引物15：CCGTCGCTATCAAGGAACC

ARMS引物16：CCGTCGCTATCAAGGAACC

ARMS引物17：CGTCGCTATCAAGGAATCTC

ARMS引物18：CCGTCGCTATCAAGGAACC

ARMS引物19：CCGTCGCTATCAAGGAACAG

ARMS引物20：GTCGCTATCAAGGAATCATC

ARMS引物21：CGTCGCTATCAAGGAATCTC

ARMS引物22：GTCGCTATCAAGGAATTCGA

ARMS引物23：AGCCTACGTGATGGCCAT

ARMS引物24：CCAGCGTGGCCAGCGT

ARMS引物25：CCAGCGTGGACGGTAAC

ARMS引物26：GACAATTCCCACCACGTGT

ARMS引物27：CACCGTGCAGCTCATCAT

ARMS引物28：AGATCACAGACTTTGGGCG

ARMS引物29：GTTGGGCTGGCCAAACA；

ARMS引物1和2對應的下游引物為Y1：AGACCATGAGAGGCCCTG；

ARMS引物3對應的下游引物為Y2：AGATGATGGAAATATACAGCTTGC；

ARMS引物4～19對應的下游引物為Y3：TGTGGAGATGAGCAGGGT；

ARMS引物20～27對應的下游引物為Y4：TTGTCTTTGTGTTCCCGGA；

ARMS引物28和9對應的下游引物為Y5：GGCTGACCTAAAGCCACC；

ARMS引物1～3對應的中介引物為Z1：ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCGGTGCGTTCGGCACGGTGTATA；

ARMS引物4～22對應的中介引物為Z2：ACCTCGTTCTGGGCTCTACTCCATGGCTCTGAACCTCA；

ARMS引物23～27對應的中介引物為Z3：ACCTCGTTCTGGGCTCTACCTGCCTCCTGGACTATG；

ARMS引物28和9對應的中介引物為Z4：ACCTCGTTCTGGGCTCTACCCATGCAGAAGGAGGCAA。

10.根據權利要求8或9所述的EGFR多點突變單管快速檢測試劑盒，其特征在于：通用熒光探針的序列為：TC(dT-?FAM)GCGGTGTTGGTGTAGAGCCCAGAACGAGGTTTTTTTTTTTTTTTTTT，對應的淬滅序列為：5’-BHQ-CCGCAGA-3’。