[發(fā)明專利]可控的基因組修飾瘧原蟲、重組表達(dá)載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201410429012.6
• 申請日: 2014-08-27
• 公開（公告）號: CN105368865B
• 公開（公告）日: 2019-04-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇鐘;王瓊
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院
• 主分類號: C12N15/79
• 分類號: C12N15/79;C12N15/66;C12N1/11;A61K39/015;A61P33/06;C12R1/90
• 代理公司: 廣州華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 鄭彤;萬志香

本發(fā)明涉及一種可控的基因組修飾瘧原蟲、重組表達(dá)載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用。該重組表達(dá)載體包括基因打靶的長、短同源臂以及位于兩同源臂之間的四環(huán)素阻遏蛋白基因表達(dá)框、乙胺嘧啶抗性基因表達(dá)框以及目的基因表達(dá)框，而目的基因啟動子的多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)處插入四環(huán)素操縱基因序列，從而該重組表達(dá)載體可以用于條件性研究瘧原蟲基因組中某個功能基因的功能。此外，配合基因敲除技術(shù)，將瘧原蟲基因組中與目的基因?qū)?yīng)的功能基因表達(dá)序列敲除，同時將該重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染進(jìn)基因敲除的瘧原蟲內(nèi)，可以獲得可控的基因組修飾瘧原蟲，并為進(jìn)一步研究瘧原蟲基因組中各功能基因的功能提供了新的技術(shù)方案，具有廣泛的應(yīng)用前景。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其是涉及一種可控的基因組修飾瘧原蟲、重組表達(dá)載體及構(gòu)建方法、應(yīng)用。

背景技術(shù)

由瘧原蟲感染引起的瘧疾是全球三大主要傳染性疾病之一。每年有數(shù)億人感染瘧疾，逾百萬人因瘧疾死亡，其中多數(shù)是5歲以下的兒童。瘧疾難以有效控制和根除的主要原因之一在于對其病原體—瘧原蟲的生物學(xué)復(fù)雜性了解有限。瘧原蟲具有復(fù)雜的生活史，其生長發(fā)育需要在雌性按蚊和人(或其他脊椎動物)等宿主體內(nèi)完成：瘧原蟲在按蚊體內(nèi)進(jìn)行有性繁殖，而在人或其他脊椎動物宿主體內(nèi)則進(jìn)行無性繁殖。瘧原蟲在宿主體內(nèi)的發(fā)育過程分為肝期(紅外期)和紅細(xì)胞內(nèi)期(紅內(nèi)期)。肝期瘧疾一般不表現(xiàn)出臨床癥狀，而瘧疾感染的主要病理反應(yīng)是由紅內(nèi)期引發(fā)的。由肝細(xì)胞釋放出的紅外期裂殖子進(jìn)入血流侵入紅細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行紅內(nèi)期增殖，蟲體增殖和釋放導(dǎo)致紅細(xì)胞破裂，從破裂紅細(xì)胞釋出的裂殖子侵入健康的紅細(xì)胞，周而復(fù)始，導(dǎo)致大量紅細(xì)胞被破壞，病人表現(xiàn)出嚴(yán)重的臨床癥狀。目前瘧原蟲基因組測序工作已基本完成，因而大量已測序基因的功能有待闡明。人們對參與瘧原蟲生活史各階段分化、發(fā)育和增殖過程中的重要基因及其調(diào)控還了解甚少。探明瘧原蟲各種基因及其基因產(chǎn)物的具體功能對于開發(fā)有效瘧疾疫苗和發(fā)現(xiàn)抗瘧新藥物靶位具有重要的意義。

因此，拓展分析瘧原蟲基因功能的方法已成為瘧疾研究的熱點(diǎn)。通過生物芯片技術(shù)與抑制性消減雜交技術(shù)(Suppressive subtractive hybridization，SSH)等技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)分析，可以篩選得到許多與瘧原蟲生長，繁殖及其對宿主作用相關(guān)的基因并預(yù)測其可能功能，但對于疫苗與新藥的開發(fā)尤為重要的是確證瘧原蟲重要基因的具體功能。早期科學(xué)家用酶抑制分子研究酶蛋白的功能，但由于酶抑制物的低特異性以及應(yīng)用范圍的局限性限制了這種方法的發(fā)展。隨著瘧原蟲基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，實(shí)驗(yàn)者可以通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行靶基因失活直接研究該基因功能。RNA干擾(RNA interference，RNAi)與基因敲除(gene knockout)技術(shù)是目前在哺乳動物應(yīng)用較多的基因失活方法，然而，瘧原蟲基因組中缺少RNAi所需的重要元件，因而RNAi在瘧原蟲中的應(yīng)用仍存在困難。基因敲除是研究基因功能的經(jīng)典遺傳學(xué)方法，但由于紅內(nèi)期瘧原蟲為單倍體，對紅內(nèi)期瘧原蟲具有重要功能的基因被敲除后將會導(dǎo)致蟲體死亡而無法研究其功能，因此，建立瘧原蟲基因條件性敲除技術(shù)將會極大地方便研究其基因功能。將基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)與基因敲除結(jié)合起來是建立基因條件性敲除技術(shù)最有效的方法之一。另有研究通過Cre/loxP或Flp/FRT系統(tǒng)與基因敲除結(jié)合實(shí)現(xiàn)基因條件敲除，但這種基因條件敲除技術(shù)局限于必須使用特異性或組織特異性啟動子，并且這種條件性敲除在該特定期或特定組織內(nèi)發(fā)生后是不可逆轉(zhuǎn)的，因此，對于大部分生長期為單倍體的瘧原蟲，仍然存在重要基因缺失后蟲體死亡或嚴(yán)重受損而不能進(jìn)行轉(zhuǎn)基因蟲篩選與克隆的難題，而對瘧原蟲各個生長期都起重要作用的基因更難以用這種方法進(jìn)行研究。動物細(xì)胞中用到的基因誘導(dǎo)表達(dá)方式常利用一些特殊的啟動子，這些啟動子在某些理化條件下可誘導(dǎo)啟動，如熱休克蛋白啟動子可在高溫下被誘導(dǎo)、糖皮質(zhì)激素和重金屬反應(yīng)啟動子等，這些基因表達(dá)誘導(dǎo)方式存在以下缺陷：誘導(dǎo)表達(dá)特異性差，系統(tǒng)處于關(guān)閉狀態(tài)時表達(dá)有泄漏，誘導(dǎo)劑本身有毒性對細(xì)胞造成損傷等。1992年，Gossen等利用大腸桿菌Tn10轉(zhuǎn)座子的四環(huán)素抗性操縱子為基礎(chǔ)構(gòu)建了可用于研究哺乳類動物基因功能的四環(huán)素調(diào)控的tet-off基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括調(diào)節(jié)單元和應(yīng)答單元二部分。調(diào)節(jié)部分表達(dá)的轉(zhuǎn)錄激活因子(tTA)在四環(huán)素存在的情況下不激活目的基因表達(dá)；而在四環(huán)素去除后，tTA可激活應(yīng)答單元中目的基因表達(dá)。而后Gossen等對tet-off系統(tǒng)進(jìn)行了改造，構(gòu)建了受四環(huán)素調(diào)控的Tet-on基因誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)在沒有誘導(dǎo)劑的條件下啟動子不被激活，而在加入誘導(dǎo)劑后目的基因高效表達(dá)。tet-on系統(tǒng)具有嚴(yán)密、高效、可控制性強(qiáng)和誘導(dǎo)速度快等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛用于基因功能研究。但已廣泛用于真核生物的tet-on系統(tǒng)不適用于瘧原蟲，因?yàn)橄到y(tǒng)包含的調(diào)節(jié)單元和應(yīng)答單元中的關(guān)鍵元件單純皰疹病毒HSV蛋白(herpessimplex virus virion protein16，VP16)和四環(huán)素應(yīng)答元件(tetracycline-responsiveelement，TRE)在瘧原蟲中不工作。許多與瘧原蟲種屬接近的原蟲類生物已成功應(yīng)用四環(huán)素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控基因表達(dá)：如布氏錐蟲(Wirtz E.等,Science,1995,268:1179-1183)、阿米巴原蟲(Hamann L.等,Mol.Biochem.Parasitol.1997,84:83-91.)、利氏曼原蟲(Yan S.等，Woods Hole Mol.Parasitol.Meet.,10th,1999.)、藍(lán)氏賈第鞭毛蟲(Sun CH.等，Mol.Biochem.Parasitol.2000,105:51-60.)、弓形蟲(Meissner M.等,Science,2002,298:837-840.)等。然而，瘧原蟲的基因組富含AT堿基干擾對其基因啟動子序列的分析，也給包含瘧原蟲基因的質(zhì)粒載體在大腸桿菌的擴(kuò)增帶來麻煩；并且，瘧原蟲主要寄生于脊椎動物和人的紅細(xì)胞內(nèi)，外源性的DNA通過轉(zhuǎn)染整合到瘧原蟲基因組上需要經(jīng)過紅細(xì)胞膜、納蟲泡、蟲細(xì)胞膜與核膜四層膜，轉(zhuǎn)染效率極低，這些都給瘧原蟲的基因修飾研究造成困難。近幾年，隨著瘧原蟲核轉(zhuǎn)染技術(shù)的提高，瘧原蟲的基因修飾研究開始充滿活力。2005年，Meissner等構(gòu)建的tet-off系統(tǒng)在人惡性瘧原蟲內(nèi)調(diào)控了綠色熒光蛋白(GFP)基因表達(dá)(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2005,102(8):2980-2985)，不過，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒并未整合到瘧原蟲基因組而以游離體(episome)形式存在，而游離體容易丟失導(dǎo)致轉(zhuǎn)染結(jié)果不穩(wěn)定，受調(diào)控的基因誘導(dǎo)表達(dá)率很低(約20％)且持續(xù)時間短暫，瘧原蟲內(nèi)源性基因保持完整無敲除。2012年底，Paco Pino等建立tet-off系統(tǒng)條件性敲除PRF與NMT基因(Cell Host&Microbe 2012,12：824–834.)。Tet-off在啟動基因表達(dá)時受機(jī)體代謝誘導(dǎo)劑速度的影響，不及tet-on系統(tǒng)啟動基因表達(dá)快速、高效，而在關(guān)閉基因表達(dá)時tet-off系統(tǒng)需要持續(xù)給誘導(dǎo)劑，給基因功能研究過程帶來不方便、對瘧原蟲及其宿主存在潛在的副作用以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能受干擾等不利因素。并且，研制開發(fā)可控的基因組修飾瘧原蟲全蟲疫苗，只能選擇tet-on系統(tǒng)不可用tet-off系統(tǒng)，因?yàn)闄C(jī)體給予疫苗后不能同時給予四環(huán)素來致弱瘧原蟲。瘧原蟲基因的AT含量非常高；另外還具有許多與其它真核生物不一樣的基因特征，比如在多數(shù)真核細(xì)胞內(nèi)可以工作的CMV啟動子與SV40啟動子在瘧原蟲細(xì)胞內(nèi)不起作用，瘧原蟲基因的啟動子也常常缺少真正的TATA盒，瘧原蟲基因啟動子常有多個轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，這些都為瘧原蟲基因組的研究工作的開展增加了困難。