[發明專利]一種免疫增強劑及其在多克隆抗體制備中的應用

有效

• 申請號: 201410421624.0
• 申請日: 2014-08-25
• 公開（公告）號: CN104225578A
• 公開（公告）日: 2014-12-24
• 發明（設計）人: 沈鶴霄;華權高;陳思;徐春雷;陳瑩
• 申請（專利權）人: 沈鶴霄
• 主分類號: A61K38/22
• 分類號: A61K38/22;A61K39/39;A61P37/04
• 代理公司: 北京華沛德權律師事務所 11302
• 代理人: 劉杰

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種免疫增強劑及其在多克隆抗體制備中的應用。?

背景技術

免疫增強劑是指單獨或同時與抗原使用時能增強機體免疫應答的物質。免疫增強劑的種類繁多，包括礦物質類，如硒、鋅等；中草藥類，如黃芪、白芍、蘆薈、當歸等；免疫佐劑類，如蜂膠、弗氏佐劑等；微生物制劑類，如卡介苗、霍亂毒素B亞單位等；維生素類，如維生素A、維生素E等；氨基酸類，如精氨酸、亮氨酸等；激素或激素樣物質類，如生長激素、胸腺肽等；核酸制劑類，如多(聚)核苷酸、免疫核糖核酸等；抗寄生蟲藥物類，如左旋咪唑、甲硝唑等；其它免疫增強劑，如干擾素、蜂花粉、熱休克蛋白等。?

目前的免疫增強劑通常采用單類物質，如公開號為CN101554476A的專利中使用黃芪多糖、人參皂苷、甘草次酸作為免疫增強劑，?

發明人在實驗中發現單類免疫增強劑使用時增加機體免疫應答的作用有限，僅使用單類免疫增強劑有時不能滿足實際需要。使用單類免疫增強劑時，免疫時間較長，往往要5～6次免疫才能達到較高的效價，其耗時嚴重。?

發明內容

為解決以上技術問題，本發明提供一種免疫增強劑及其在多克隆抗體制備中的應用，解決了現有技術中單類免疫增強劑效果不佳，不能滿足實際需要的問題。?

本發明的技術方案如下：?

在上述技術方案中，所述IL-6、LPS脂多糖、胸腺肽、蜂膠液在使用前分別放置。?

以上所述的免疫增強劑在多克隆抗體制備中的應用，包括如下步驟：?

1)將含有權利要求1所述濃度的IL-6,LPS脂多糖，胸腺肽的母液與蜂膠液混合，得到免疫增強劑；?

2)將步驟1)所得免疫增強劑與抗原按照1:9的體積比混合得到抗原混合物；?

3)將步驟2)所述抗原混合物與弗氏佐劑按照1:1的體積比混合，在注射器中推拉乳化形成乳劑；?

4)免疫方法采用頸背部皮下多點注射步驟3)所得乳劑，每個點皮下注射0.2ml，共計免疫3次，每次免疫的間隔時間為7～14天；?

5)不同時間采血，分離血清，檢測抗體效價。?

在上述技術方案中，所述步驟4)中第1次免疫使用的乳劑是通過所述抗原混合物用弗氏完全佐劑乳化得到，第2～3次免疫使用的乳劑是通過所述抗原混合物用弗氏不完全佐劑乳化得到。?

本發明通過添加復方的免疫增強劑來增加免疫效果，綜合激素類(IL-6、胸腺肽)、微生物類(LPS脂多糖)和佐劑類(蜂膠液)等免疫增強劑的優點，可得到高親和力的抗體。免疫動物所用時間也大為縮短，使用單類免疫增強劑時，免疫時間較長，往往要5～6次免疫才能達到較高的效價,使用本發明復合免疫增強劑免疫2～3次即可達到較高效價，增加了獲得高質量抗體的機率。?

具體實施方式

下面結合實施例對本發明的技術方案進行詳細描述。?

實施例1多克隆抗體的制備?

(一)抗原的制備?

1.TIMP1表位分析：按NCBI網站Gene?Bank數據庫提供的人金屬蛋白酶抑制劑1基因序列，根據抗原表位軟件DNAstar分析選擇合適的目的片段用于蛋白表達。?

2.根據序列表所述序列設計引物，引物序列如下，在上下游引物的5′端分別插入BamHI和salI內切酶位點，運用Primer?Premier5.0和DNAMAN軟件對引物進行分析：?

上游引物：ATGCGGATCCACCTGTGTCCCACCCCA?

下游引物：ATGCGTCGACGGCTATCTGGGACCGC?

3.提取EC109細胞總RNA，用隨機引物反轉錄獲得cDNA，以此cDNA為模板，2所述的引物為引物進行PCR擴增獲取目的基因，將目的基因回收后連接轉化到表達載體pET28a得到表達克隆，經測序分析表達克隆序列正確以后，進行蛋白表達。?

4.將上述獲得的表達質粒，轉化大腸桿菌BL21，獲得人TIMP1表達菌株。取表達菌株，振蕩培養37℃，振蕩培養至OD600≈0.6，加入IPTG誘導，繼續誘導培養3小時。?

5.離心收集菌體。PBS清洗菌體后離心收集菌體，用PBS，4℃超聲破菌。10000rpm離心，分別收集上清與沉淀，進行SDS-PAGE電泳，結果表明hTIMP1以上清可溶形式存在。?

6.鎳離子親和層析，咪唑梯度洗脫純化hTIMP1蛋白。平衡緩沖為PBS。結果表明目的蛋白hTIMP1主要集中于200mM咪唑洗脫峰，純度大于90％。?