[發明專利]一種H-2Kd基因siRNA表達質粒及其制備方法與應用

在審

• 申請號: 201410418981.1
• 申請日: 2014-08-25
• 公開（公告）號: CN104178507A
• 公開（公告）日: 2014-12-03
• 發明（設計）人: 莊學偉;夏西燕;張義
• 申請（專利權）人: 莊學偉
• 主分類號: C12N15/63
• 分類號: C12N15/63
• 代理公司: 無
• 代理人: 無

技術領域

本發明屬于分子生物技術領域，尤其涉及一種H-2K^d基因siRNA表達質粒及其制備方法與應用。

背景技術

主要組織相容性復合體(major?histocompatibility?complex，MHC)是編碼主要組織相容性抗原的基因群，其表達產物是參與抗原提呈和T細胞激活的關鍵分子，H-2K^d是小鼠MHC?I類分子，在免疫應答和免疫調節中發揮重要作用。雙鏈RNA(dsRNA)誘導與之同源的mRNA降解，從而導致轉錄后基因緘默(post?transcriptional?genesilencing，PTGS)的現象或機制被稱為RNA干擾(RNA?interference，RNAi)。

RNAi現象和機制的研究進展非常迅速。特別是近年來，RNAi已被發展成為一個新的強有力的工具，在反向基因組學、基因治療、抗病毒感染等方面顯示出了巨大的潛力。

發明內容

本發明的目的在于提供一種H-2K^d基因siRNA表達質粒及其制備方法與應用，為進一步研究H-2K^d基因的功能及制造MHC表達下降動物模型奠定基礎。

本發明是這樣實現的，一種H-2K^d基因siRNA表達質粒，包括序列如SEQ?ID?NO：1所示的寡核苷酸1和序列如SEQ?ID?NO：2所示的寡核苷酸2配對結合而成的雙鏈寡核苷酸，其載體為線性化的pSilencer3.0-H1。

本發明進一步提供了上述H-2K^d基因siRNA表達質粒的構建方法，包括以下步驟：將合成的寡核苷酸1和寡核苷酸2等量混合，95℃作用3min，37℃孵育1h；將結合的雙鏈寡核苷酸與帶有BamHI和HindIII粘性末端的pSilencer3.0-H1載體連接，得到H-2K^d基因siRNA表達質粒。

本發明進一步提供了上述H-2K^d基因siRNA表達質粒在抑制H-2K^d基因表達方面的應用。

本發明克服現有技術的不足，提供一種H-2K^d基因siRNA表達質粒，在本發明中，由于質粒可以復制擴增，相比起化學合成來說，能夠顯著降低制備siRNA的成本。可以自行制備siRNA而不受數量的限制。質粒DNA與小鼠脾LAK細胞混合培養后，H-2K^d分子的表達率明顯下降，同時，MTT法測定不同組別的細胞活性沒有明顯改變，倒置顯微鏡下觀察，細胞形態亦沒有明顯的改變。質粒DNA及脂質體對細胞無明顯毒副作用，對H-2K^d蛋白表達的抑制作用不是通過非特異性毒副作用實現的，從而證明是抑制H-2K^d蛋白表達的有效方法。本研究采用pSilencer3.0-H1成功構建了針對H-2K^d基因的siRNA表達質粒并抑制其表達，為下一步研究H-2K^d基因的功能及制造外周血H-2K^d下降的動物模型奠定基礎。

附圖說明

圖1是本發明實施例中瓊脂糖凝膠電泳圖；

圖2是本發明實施例中插入片斷的測序圖；

圖3是本發明實施例中FCM檢測LAK細胞表面流式細胞H-2K^d的熒光直方圖。

具體實施方式

為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，以下結合附圖及實施例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發明，并不用于限定本發明。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質粒和菌株

質粒pSilencer3.0-H1購自Ambion公司；工程菌DH5a由山東大學醫學院免疫研究所饋贈。

1.1.2主要材料和試劑

T4DNA連接酶、質粒的提取及純化試劑購自Promega公司；RPMI1640培養基、胎牛血清，購自美國Gibco公司；脂質體購自Invitrogen公司；小鼠淋巴細胞分離液購自上海生化試劑公司；FITC標記的抗H-2K^d單克隆抗體及同型對照購自美國BD公司。

1.1.3測序引物

質粒中插入片段的測序采用M13通用引物：

Forward：5′-CACGACGTTGTAAAAGAC-3′