[發(fā)明專利]一種河豚毒素免疫親和柱及其制備方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201410413740.8
• 申請(qǐng)日: 2014-08-21
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105467120A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 柳家鵬
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江蘇美正生物科技有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/577
• 分類號(hào): G01N33/577;G01N33/569;G01N33/531
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技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種河豚毒素的免疫親和柱及其制備方法，屬于水產(chǎn)毒素檢測(cè)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

河豚毒素（Tetrodotoxin，TTX）是豚魚(yú)類（俗稱河豚魚(yú)）、其它多種海洋生物以及蠑螈、火蜥蜴、青蛙、蟾蜍、扁形蟲(chóng)等動(dòng)物體內(nèi)含有的一種生物堿（氨基全氫喹唑啉型化合物），是自然界中所發(fā)現(xiàn)的毒性最大的神經(jīng)毒素之一，其分子式為C₁₁H₁₇O₈N₃，分子量為319，是小分子量、非蛋白質(zhì)的神經(jīng)性毒素，其毒性比劇毒的氰化鈉還要高1250多倍，0.5mg即可致人于死命。河豚毒素對(duì)腸道有局部刺激作用，吸收后迅速作用于神經(jīng)末梢和神經(jīng)中樞，阻礙神經(jīng)傳導(dǎo)，從而引起神經(jīng)麻痹而致死亡。其具體作用機(jī)制是通過(guò)與鈉離子通道受體結(jié)合，阻斷電壓依賴性鈉通道，從而阻滯動(dòng)作電位，導(dǎo)致與之相關(guān)的生理活動(dòng)的阻礙，主要是神經(jīng)肌肉的麻痹，河豚毒素對(duì)呼吸和心血管的抑制是對(duì)中樞和外周神經(jīng)共同作用的結(jié)果。河豚毒素的化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，一般烹調(diào)手段難以破壞，中毒后也缺乏有效的解救措施。因此TTX的檢測(cè)具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義。

TTX檢測(cè)技術(shù)主要包括以小鼠檢測(cè)法為代表的生物檢測(cè)技術(shù)；以熒光分光光度法、液相色譜檢測(cè)法為代表的儀器檢測(cè)技術(shù)。小鼠檢測(cè)法是利用河豚毒素的毒性特點(diǎn)進(jìn)行的小鼠毒性檢測(cè)的方法，方法簡(jiǎn)便，但定量不準(zhǔn)確且重復(fù)性差、目標(biāo)性差，已少用。熒光分光光度法是最早建立的測(cè)定TTX的儀器方法，操作簡(jiǎn)便,但靈敏度低、專一性差。高效液相色譜法(highperformanceliquidchromatography,HPLC)對(duì)樣品的適用性廣,不受分析對(duì)象揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，因而彌補(bǔ)了氣相色譜法的不足。是定量分析真菌毒素最常用的方法。

在使用高效液相色譜檢測(cè)河豚毒素時(shí)，需要先將河豚毒素樣品進(jìn)行凈化處理。目前常用的凈化處理方法就是固相萃取法，也叫柱層析法。是目前真菌毒素凈化使用最廣泛的方法。其中，免疫親和柱方法的分析速度快,靈敏度高,分離效率和回收率高,不需要?jiǎng)《镜恼婢舅貥?biāo)準(zhǔn)物來(lái)標(biāo)定,安全可靠。因而成為最常用的方法。

用于目前制備免疫親和純化柱的方法大概有：溴化氰活化直接偶聯(lián)法、環(huán)氧氯丙烷法、過(guò)碘酸鈉法等。這些方法的基本原理都是將載體基質(zhì)進(jìn)行化學(xué)活化后，將抗體偶聯(lián)到載體上。但是由于偶聯(lián)是非特異性的，抗體的任何部位都有可能和載體偶聯(lián)，方向性是不可控制的。勢(shì)必影響親和純化柱純化河豚毒素的效率。

發(fā)明內(nèi)容:

本發(fā)明的目的在于提供一種河豚毒素免疫親和柱及其制備方法和用途。

為了達(dá)到上述目的，在本發(fā)明中，利用了蛋白G的功能，蛋白G是一種G型鏈球菌細(xì)胞壁上的蛋白，能特異性的與多種動(dòng)物抗體的Fc部位相結(jié)合。并且具有很高的親和力。我們克隆了蛋白G的基因序列，并且對(duì)其密碼子進(jìn)行了優(yōu)化、重組后，在大腸桿菌中表達(dá)出了與抗體有高親和力的基因重組蛋白G。將基因重組的蛋白G偶聯(lián)到載體上后，再將河豚毒素抗體偶聯(lián)到蛋白G上，制備出了河豚毒素—蛋白G—載體，再用交聯(lián)劑將載體進(jìn)行交聯(lián)。交聯(lián)后的載體裝柱后就形成了高親和力的河豚毒素免疫親和柱。該親和柱操作簡(jiǎn)便，純化河豚毒素效率高。樣本經(jīng)過(guò)簡(jiǎn)單的處理后就可以進(jìn)行純化，得到純度很高的河豚毒素。用于高效液相色譜檢測(cè)。

具體操作如下：

本發(fā)明最大的優(yōu)勢(shì)就是利用了蛋白G與Ig抗體特異性結(jié)合的特點(diǎn)，IgG抗體由兩條重鏈和兩條輕鏈構(gòu)成，抗體分為Fab區(qū)和Fc區(qū)，其中，F(xiàn)ab區(qū)是抗原結(jié)合的區(qū)域。

蛋白G是鏈球菌細(xì)胞壁上的一種特殊的蛋白，與抗體的Fc區(qū)域有特異性的結(jié)合能力。蛋白G與抗體結(jié)合后，抗體的Fab區(qū)域游離在外，不影響抗體的抗原結(jié)合能力。經(jīng)過(guò)我們基因優(yōu)化重組后的蛋白G，1個(gè)分子的蛋白G可以結(jié)合3個(gè)分子的IgG抗體，具有很高的抗體親和力。并且只有抗體能與蛋白G結(jié)合，其余蛋白均不能與蛋白G結(jié)合，特異性很高。以此蛋白G為基礎(chǔ)制備的免疫親和柱具有特異性好，河豚毒素結(jié)合量大，純化效率高的特點(diǎn)。

河豚毒素免疫親和柱及其制備方法說(shuō)明如下:

1.載體活化

選擇瓊脂糖載體，sepharose4B，以環(huán)氧氯丙烷活化法進(jìn)行活化。

取2%的預(yù)溶脹的瓊脂糖凝膠sepharose4B，用20倍體積的蒸餾水充分沖洗，洗去殘存的乙醇，用漏斗過(guò)濾掉水分。

稱取濾去水份后的濕凝膠5克，加入7.5毫升0.8M的NaOH，30%的環(huán)氧氯丙烷2毫升，2mg/ml的硼氫化鈉NaBH4,5毫升，在25℃下?lián)u床反應(yīng)8小時(shí)。