[發明專利]一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法

有效

• 申請號: 201410413383.5
• 申請日: 2014-08-21
• 公開（公告）號: CN104165947A
• 公開（公告）日: 2014-11-26
• 發明（設計）人: 楊柳;秦嶺;王建立;劉帥;曹慶琴;邢宇;張卿
• 申請（專利權）人: 北京農學院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 北京中恒高博知識產權代理有限公司 11249
• 代理人: 高松

技術領域

本發明涉及一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法。

背景技術

植物體內具有多種內源激素，其含量及存在形式不斷變化，并產生一系列生理生化反應，在一定程度上影響和控制植物的生長、發育、成熟和衰老等過程。生長素參與根和莖的發育和生長、器官的衰老、維管束組織的形成和分化發育，以及植物的向地和向光反應等。ABA能促進果實與葉片脫落、器官衰老和氣孔關閉、影響植物開花、調節種子和胚的發育等生理功能。果實中激素的種類及含量的多少直接影響果實的發育，因此建立合理實用的激素含量分析方法，對研究植物的生長發育有重要意義。

植物組織中生長素（吲哚-3-乙酸，IAA）和脫落酸(ABA)含量甚微，測定困難，目前植物內源激素的分析方法主要有酶聯免疫法（ELISA）、放射免疫法（RIA）、高效液相色譜法（HPLC）、氣質聯用（GC-MS）和液質聯用（LC-MS）等。液相色譜選擇性和特異性差，氣質聯用衍生過程繁瑣。液質聯用不需目標物衍生處理，操作簡便，而且靈敏度高、選擇性和特異性好，然而目前所報道的液質方法，前處理凈化只采用傳統的固相萃取凈化，操作繁瑣、耗時費力，無法實現標準化、自動化，人為誤差較大，無法保證定量結果的準確性和可靠性。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供了一種定量測定植物中生長素與脫落酸含量的方法。本發明在多種分析方法的基礎上，通過改進液質聯用分析方法中的前處理方法，采用在線SPE/凝膠凈化/定量濃縮多聯機系統的固相萃取（SPE）和定量濃縮（EVA）功能，該儀器可以自動完成SPE凈化過程，且EVA由真空、加熱、氮吹三位一體構成，三道紅外傳感器可精確定容，具有多種溶劑轉換、蒸發至干、自動稀釋、定量轉移等功能，該系統常見于果蔬中農藥的殘留、土壤及動物血液中有毒物質及食品中塑化劑的前處理過程，在植物激素測定的方法中未見報道。對待測樣品中IAA和ABA進行液相色譜串聯質譜(high-performance?liquid?chromatography-tandem?massspectrometric，LC-MS/MS)研究，采用添加同位素（D₅-IAA,D₆-ABA）到樣品中作為定量測定的手段，保證了定性、定量結果的可靠性，為植物體內源激素的研究提供了關鍵技術方法。

為了實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

本發明提供了一種定量測定植物中生長素和脫落酸含量的方法，步驟如下：將樣品研磨后用甲醇進行浸提，加入內標D5-IAA和D6-ABA，用凈化-定量-濃縮多聯機系統的EVA功能濃縮溶液，用乙酸乙酯等體積萃取激素，用氮氣吹干，再用HAc溶解，用凈化-定量-濃縮多聯機系統中的SPE功能過固相萃取柱純化，收集洗脫樣品；將洗脫樣品干燥后，用甲醇溶解得到待測樣品，將待測樣品采用液質聯用方法測定并計算生長素和脫落酸的含量。

優選地，所述樣品的質量為0.5g-2.0g。

進一步地，所述樣品的質量為0.5g。

優選地，所述甲醇的體積百分比濃度為70-90%。

進一步地，所述甲醇的體積百分比濃度為80%。

優選地，所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35-45℃。

進一步地，所述濃縮溶液時的濃縮溫度為35℃。

優選地，所述固相萃取柱為C18柱。

本發明建立了凈化-定量-濃縮多聯機系統—液相色譜—質譜聯用儀（GPC-HPLC-MS/MS），內標法定量測定植物組織中吲哚-3-乙酸（IAA）和脫落酸(ABA)的方法。實驗以板栗為材料，通過正交試驗篩選出最適的提取與純化方法，結果表明：經檢測，取材料0.5g，80%甲醇（預冷）4℃冰箱中浸提過夜，并加入500ngD6-ABA，100ngD5-IAA35℃濃縮至水相，用乙酸乙酯等體積萃取激素，氮吹至干，用HAc溶解，經C18小柱純化，ABA與IAA的含量相對較高。

本發明通過優化板栗IAA、ABA兩種內源激素的提取純化條件，建立了一個省時、高效的LC-MS/MS分析方法，分離效果理想。僅0.50g的樣品用量，大大減少了分析樣品的用量，并有利于操作步驟的簡化，雜質少。實驗中采用GPC純化系統完成多個步驟，實現前處理的自動化，縮短了操作時間，減少系統誤差，使前處理過程更加精準。內源激素與所用內標的結構式非常相近，因而在提取、純化過程中內源激素與內標均同步進行，兩者同時進入色譜柱，幾乎有相同的保留時間。

附圖說明