[發明專利]一種TAT-BH3-NΔ19 RhoGDI2融合蛋白及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201410412110.9
• 申請日: 2014-08-20
• 公開（公告）號: CN104356239A
• 公開（公告）日: 2015-02-18
• 發明（設計）人: 孫愛友;魏東芝;趙志強;徐瑞
• 申請（專利權）人: 華東理工大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/13;C12N15/70;A61K38/08;A61K38/17;A61P35/00
• 代理公司: 上海科盛知識產權代理有限公司 31225
• 代理人: 葉敏華

1.一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，為TAT穿膜肽和促凋亡短肽BH3串連在NΔ19?RhoGDI2的N端形成的融合蛋白，該融合蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

2.根據權利要求1所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，所述的TAT穿膜肽的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示，所述的促凋亡短肽BH3的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示，所述的NΔ19?RhoGDI2的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：4所示。

3.根據權利要求1所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白，其特征在于，編碼該融合蛋白的基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：5所示。

4.一種如權利要求1～3任一所述的TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包括以下步驟：

(1)構建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2重組質粒；

(2)利用大腸桿菌BL21異源表達eXact-TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白；

(3)分離純化eXact-TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白。

5.根據權利要求4所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(1)所述的構建pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2重組質粒具體包括以下步驟：

a.以序列如SEQ?ID?NO：6所示的上游引物和序列如SEQ?ID?NO：7所示的下游引物為反應引物，以全長的RhoGDI2基因為模板，其中RhoGDI2基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：8所示，PCR反應，獲得TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的編碼基因，即目的基因；

b.用基因純化試劑盒對PCR產物進行純化，將目的基因和pPAL7/eXact表達質粒用BamH?I和HindIII進行雙酶切，T4連接酶連接后，獲得pPAL7/eXact-TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2重組質粒，將該重組質粒轉化到大腸桿菌BL21中，挑選陽性克隆送樣測序。

6.根據權利要求5所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，所述的PCR反應的條件是：94℃預變性5min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸50s，循環30次，最后72℃延伸5min。

7.根據權利要求4所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(2)所述的利用大腸桿菌BL21異源表達eXact-TAT-BH3-NΔ19RhoGDI2融合蛋白具體包括以下步驟：

將測序正確的含有pPAL7/eXact-BH3-TAT-NΔI9?RhoGDI2重組質粒的大腸桿菌BL21在含有100μg/mL氨芐霉素的LB培養基中37℃培養，當OD₆₀₀達到0.6時，加入終濃度為1mM的IPTG，37℃誘導4h，異源表達eXact-BH3-TAT-NΔ19RhoGDI2融合蛋白。

8.根據權利要求4所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的制備方法，其特征在于，步驟(3)所述的分離純化eXact-TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白具體包括以下步驟：

在上樣過程中，Profinity?eXact純化系統中固定化的枯草桿菌蛋白酶識別并親和帶eXact標簽的蛋白質，隨后加入洗脫緩沖液，使枯草桿菌蛋白酶切斷融合蛋白上的標簽，最終得到僅帶有自身天然氨基酸序列的高度純化的目標蛋白，即TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白。

9.一種如權利要求1～3任一所述的TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的應用，其特征在于，所述的TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白用于抑制癌細胞的增殖和侵襲。

10.根據權利要求9所述的一種TAT-BH3-NΔ19?RhoGDI2融合蛋白的應用，其特征在于，所述的癌細胞包括膀胱癌T24細胞、肺癌A549細胞及膀胱癌UM-UC-3細胞。